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PBEF/Nampt/Visfatin是2005年日本学者新发现的一种脂肪因子,位于染色体7q22.1和7q31.33之间,长37.41kb;在进化过程中高度保守,细菌、脊椎动物海绵动物门、鱼类中都有同源蛋白。目前其相关功能及作用机制不明,现认为主要作用为直接降低血糖的作用,作用效用约为胰岛素的1/10。与肥胖与2型糖尿病等代谢性疾病紧密相关。
本实验通过采用特殊动物模型--朗德鹅,应用强制填饲技术建立腹型肥胖动物模型,分析了填饲前后朗德鹅各项生理指标及血糖、血脂指标,以及其代谢紊乱状态。应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测肥胖组和正常生长组PBEF/Nampt/Visfatin基因脂肪、肝脏等13处组织的表达状况,建立了组织表达谱,并进行了两组表达差异分析。克隆了朗德鹅PBEF/Nampt/Visfatin基因部分序列,并根据该序列应用RACE(cDNA末端快速扩增技术,rapid-amplificationofcDNAends)获得了朗德鹅PBEF/Nampt/Visfatin的cDNA全序列并做了相关分析。
1.动物模型的建立及相关指标分析
方法:使用90日龄朗德鹅公鹅30只,随机平均分为2组笼养。填肥组高频填饲高能玉米,对照组自由采食普通饲料,两组均自然采水。21天后测量体重(活重)、肝重、腹脂重;检测血脂七项(总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固、低密度脂蛋白胆固醇、脂蛋白、游离脂肪酸、磷脂)、血糖。并获得组织样本,液氮冻存后备用。
结果:填肥组较对照组体重、肝重、腹脂重(p<0.01)极显著增高,血糖显著增高(P<0.05),血甘油三酯(P<0.01)、总胆固醇和游离脂肪酸(P<0.05)显著增高,两组间高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、胆固醇,脂蛋白和磷脂等指标两组无统计学差异(p>0.05);
对照组中各参数相关性如下:肝重与腹脂重、肝重与磷脂呈极显著正相关性、脂蛋白a与总胆固醇呈极显著负相关性;高密度脂蛋白胆固醇与甘油三酯呈显著负相关性、低密度脂蛋白胆固醇与腹脂重呈显著正相关性、游离脂肪酸与肝重呈显著正相关性、游离脂肪酸与总胆固醇呈显著正相关性。其他指标见未见显著相关性。
填肥组中各参数相关性如下:体重与腹脂重显著正相关性,总胆固醇与体重显著负相关性,余指标未见明显相关性。
2.建立组织表达谱及填肥组与对照组差异分析
方法:Trizol技术提取各组织mRNA,根据NCBI上鸡PBEF/Nampt/Visfatin基因全序列上保守段设计引物,逆转录获得cDNA序列,克隆扩增获得精确部分朗德鹅PBEF/Nampt/Visfatin序列,根据此段精确序列设计荧光定量专用引物,应用RT-PCR技术获得组织表达数据,通过2-△△方法分析得出两组各组织的表达差异。
结果:各组织中PBEF/Nampt/Visfatin基因均有不同程度表达,对照组与填肥组中肌肉组织表达均较高(胸肌、腿肌、心肌),脾、胰等实质器官组织表达均较低;表达量高低如下:对照组:胸肌、肾、心肌、腿肌、腹脂、胃、脑、皮下脂肪、肠、肝、胰、肺、脾;填肥组:胸肌、腿肌、心肌、肝脏、腹脂、肾、胃、肺、皮下脂肪、脑、脾、胰、肠。PBEF/Nampt/Visfatin基因表达量填肥组与对照组表达量半定量结果显示,肥胖后脾脏与肝脏PBEF/Nampt/Visfatin基因表达增加,分别为对照组的6.8-38.05与5.57-6.94倍,小肠表达量减少,填肥组约为对照组的10%-39%;余组织个体差异较大,倍比关系不明显。
3.PBEF/Nampt/Visfatin全序列的获得及分析
方法:根据前述获得PBEF/Nampt/Visfatin已知序列设计引物,使用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆测序获得全序列;通过在线核酸序列资源库进行氨基酸序列及蛋白结构预测,并进行各物种间该基因相似性比较。
结果:获得PBEF/Nampt/VisfatincDNA编码区序列1481bp,鹅该基因与各物种相似性非常高。
结论:强制填饲后朗德鹅脂代谢、糖代谢均发生严重紊乱,多个参数的相关性较对照组显著改变。PBEF/Nampt/Visfatin在组织内广泛表达,骨骼肌是该基因的主要表达部位,肥胖后脾、肝表达量增加,而小肠表达量减少;余组织变化个体差异大,需进一步确定。PBEF/Nampt/VisfatincDNA编码区序列长1481bp,该基因具有高度保守性,该蛋白属于磷酸核糖转移酶超家族。