家蚕(Bombyx mori)是卵滞育性鳞翅目模式昆虫。滞育诱导并非滞育当时的环境条件,而是亲代卵孵化期的温度、光节律等环境因子,而亲代蛹期雌性咽下神经节(SG)分泌的滞育激素(DH)水平和产卵后温度,是确定子代卵滞育性的直接因素。家蚕滞育卵中存在一种与能量利用有关的酯酶特殊成分(Esterase A4, EA4),其酯酶瞬时活性(ATPase)有依赖低温和盐酸刺激等环境活化刺激因子、出现蛋白空间结构变化的特性,被称为时间间隔测定酶(Time Interval Measuring Enzyme,TIME)。蛋白质生物测时是在家蚕首先发现的一种生物测时方式。为了解家蚕卵EA4的滞育生物钟调控机制,本文以家蚕C108品种为材料,克隆了ea4全基因,分析了EA4蛋白质的结构特性和分子进化,用RT-PCR和胚胎原位杂交等方法调查了不同滞育性蚕卵及其亲代幼虫至成虫不同组织的ea4基因表达谱。EA4蛋白质在家蚕卵中具有稳定的超氧化物歧化酶(SOD)活性,大鼠过氧化氢酶基因(cat)属于概日节律钟基因clock的一个钟控基因(clock-controlled gene)。为了解家蚕滞育过程中cat基因的表达特征,我们调查了家蚕sod、cat以及与家蚕滞育卵特征性能量代谢相关的山梨醇脱氢酶基因(sdh)的表达。在本实验室获得的ea4基因ORF序列(NCBI:DQ086424)和全长cDNA序列(NCBI:EF121773)基础上,本文克隆、拼接完成了ea4基因的3个内含子,获得了ea4全基因序列(NCBI:EF121772)。ea4基因全长10 265 bp,有4个外显子(23 bp、69 bp、204 bp和309 bp)、3个内含子(4 889 bp、3 521 bp和1 250 bp),内含子与外显子之间的连接符合GT-AG法则。蛋白质同源性分析表明,家蚕EA4不具备羧酸酯酶丝氨酸活性核心结构域(Carboxylesterase type-B serine active site : FGGdpelItLfGeSAG),而具有Cu/Zn-SOD的核心结构域,与小鼠、牛、斑马鱼等Cu/Zn-SOD家族成员同源性较高(48%-50%)。分子进化分析表明,家蚕EA4与小鼠、斑马鱼、线虫和果蝇等物种,甚至家蚕的Cu/Zn-SOD家族蛋白的进化距离都较远,而与酯酶较近。推测家蚕EA4蛋白是起源于Cu/Zn-SOD家族,正向酯酶家族进化的一种新型酯酶,也是其具有稳定的SOD活性和瞬时酯酶生物钟活性的双重酶活性现象的原因。RT-PCR和胚胎原位杂交方法研究表明,家蚕亲代卵在不同温度、光节律等滞育性诱导条件下,孵化后幼虫至成虫期ea4基因的转录水平不存在发育时期的特异性;在蚕卵形成的5龄幼虫期,生殖腺和脂肪体,以及中肠、血液和丝腺中都有ea4基因的转录产物,没有出现明显的组织特异性。子代处女蛾卵、产卵后0.5 h卵等合子未形成的滞育性卵中,有大量的母源ea4 mRNA;产卵后24 h滞育性卵中有较多的ea4 mRNA,此时用盐酸活化处理,此后的胚胎活化和发育过程中,ea4基因一直维持高水平的转录活性。家蚕EA4由幼虫至成虫期母体非特异性合成后储存于卵。家蚕TIME-EA4的调控不依赖于日节律。蚕卵不同滞育性及不同活化环境与家蚕sod、cat和ea4基因表达的关系研究表明,虽然家蚕亲代卵孵化温度和光节律是诱导次代卵滞育的条件,但孵化后幼虫至成虫期sod、cat和ea4基因的表达,不同诱导条件之间没有明显的时空特异性,也未出现明显的节律变化。孵化温度和光节律对家蚕滞育性的诱导作用可能没有通过sod、cat和ea4基因调控,或者不在幼虫至成虫期、或者次代卵期作用,cat基因在家蚕中是否为概日节律相关基因有待于进一步调查亲代卵期的表达情况。虽然盐酸处理后的活化家蚕卵与非滞育卵一样,几乎不发生糖原转变成山梨醇和甘油的反应,但与非滞育卵中sdh基因没有转录活性不同,盐酸活化卵与滞育卵一样,有较高的sdh基因转录活性。家蚕卵sdh基因的表达可能取决于亲代滞育决定关键时期的诱导因子。在产下24 h-88 h的非滞育性蚕卵和盐酸处理后24 h-168 h的活化蚕卵中,sod基因表达水平(sod以及sod+ea4)较高,而在产下0 h-72 h的滞育性蚕卵以及产下0 h-24 h的非滞育性蚕卵中刚好相反。这与不同滞育性蚕卵的H2O2代谢特征比较吻合。