研究背景心肌肥厚（myocardial hypertrophy）是心肌重塑的重要表现,是心脏在长期容量负荷及压力负荷增加时做出的适应性反应。心肌肥厚对维持病理情况下的心脏功能具有一定意义,但同时也是缺血性心脏病和心源性猝死等心血管疾病发生发展的共同病理过程。神经体液、能量代谢失衡、氧化应激等因素均可通过特定信号通路参与心肌肥厚的发生发展[1,2],但相关信号通路的具体调控机制至今仍未完全阐明,给新药研发带来困难。对该问题的探讨可以更有针对性地为防治心肌肥厚提供潜在的干预靶点。已知受体相互作用蛋白3（receptor-interacting proteins kinase 3,RIP3）是细胞程序性坏死过程中必不可少的调控蛋白[3]。RIP3是RIP家族的成员之一,在胰腺、胃肠、肺、肝、肾、心脏等成熟组织中广泛表达[4],其N端有一个典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域,可对下游靶标进行磷酸化调控,进而调节包括心脏在内的多种器官和组织的病理生理过程。作为程序性坏死的关键调控蛋白,RIP3在血管粥样硬化、缺血-再灌注损伤、心肌梗死、心肌炎、心力衰竭等心脏疾病的发生发展中均有重要的作用[5-8]。然而,RIP3是否参与心肌肥厚的发生发展尚未见报道。混合谱系蛋白激酶样结构域（Mixed lineage kinase domain-like,MLKL）是RIP3的底物。一般情况下,MLKL以无活性的单体存在于细胞质中。活化的RIP3通过磷酸化MLKL的357苏氨酸和358丝氨酸位点来募集并激活MLKL[9]。活化的MLKL易位至细胞膜和细胞器膜,与脂类物质磷脂酰肌醇和心磷脂结合,促进了钙离子或是钠离子的流入,形成穿孔通道,从而介导了细胞的程序性坏死[10]。研究表明RIP3和MLKL之间复合物的形成是诱导细胞发生程序性坏死的必要步骤[9]。RIP3/MLKL信号通路参与多种心脏疾病的发展过程,如:RIP3和MLKL在长春碱引起的心肌损伤中显著增加[11]。此外,抑制RIP3和MLKL的激活可减轻心力衰竭[12]。然而,目前尚未有研究报道RIP3/MLKL通路是否参与心肌肥厚进程。因此,本研究采用慢性压力超负荷大鼠心肌肥厚模型,并用血管紧张素II（Ang-II）或苯肾上腺素（PE）刺激新生乳鼠心肌细胞（neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs）,模拟神经体液应激,观察RIP3在肥厚的心肌组织及肥大心肌细胞中表达水平,通过体内及体外实验探讨过表达或沉默RIP3对心肌肥厚的影响。此外,本研究探寻了RIP3-MLKL信号通路是否参与了心肌肥厚的发生发展过程及其相关的信号机制。为心肌肥厚的发病机制及其药物研发提供新的依据。第一部分RIP3在肥厚的心肌组织及肥大的心肌细胞中表达的变化目的:在动物及细胞水平观察RIP3、ANP、β-MHC在主动脉缩窄所致的肥厚的心肌组织及血管紧张素II（Ang-II）或苯肾上腺素（PE）诱导的肥大的心肌细胞中表达水平的变化。方法:1.将成年Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠进行随机编号,然后将其分为假手术组（Sham组）和主动脉缩窄模型组（AB组）,观察各组大鼠的活力、饮食及饮水等一般情况。在造模后的2周、4周、6周通过RT-q PCR检测大鼠心肌组织中RIP3的m RNA表达水平的变化,Western Blot检测RIP3、ANP、β-MHC蛋白表达水平的变化。2.用Ang-II或PE刺激新生乳鼠心肌细胞（neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs）24小时、48小时、72小时,模拟神经体液应激,诱导原代乳鼠心肌细胞肥大,通过RT-q PCR检测肥大的心肌细胞中RIP3的m RNA表达水平的变化,Western Blot检测RIP3、ANP、β-MHC蛋白表达水平变化。结果:1.与对照组相比,主动脉缩窄手术组术后2w心肌组织中RIP3、β-MHC、ANP蛋白表达无明显变化,术后4w上述蛋白表达明显升高,且RIP3与β-MHC和ANP的表达水平密切相关,术后6w上述蛋白表达水平升高程度更为显著,而RIP3的m RNA表达水平在AB手术组或Sham组均无明显的统计学差异。2.与PBS处理组相比,PE或Ang-II处理乳鼠心肌细胞48小时后RIP3、β-MHC、ANP蛋白表达升高,处理72小时后上述蛋白表达水平进一步升高,然而RIP3的m RNA表达水平没有显著变化。结论:1.在主动脉缩窄建立的慢性压力超负荷大鼠心肌肥厚模型中,AB组术后4周出现明显的心肌肥厚,随着造模时间的延长,心肌肥厚的程度加重。2.Ang-II或PE处理24小时可诱导新生乳鼠心肌细胞肥大,随着处理时间延长,心肌细胞肥大程度加重。3.RIP3在心肌肥大的发生发展过程中发挥重要的作用,且RIP3表达水平的变化是在转录后水平引起的,表明RIP3可能是心肌肥厚的重要调控靶点。第二部分RIP3在体内外心肌肥大模型中的调控作用目的:在体内外分别敲低或过表达RIP3,探讨RIP3在体内外心肌肥大模型中的调控作用。方法:1.利用慢病毒,使用靶向RIP3的sh RNA（sh-RIP3）修饰RIP3的表达以下调NRCMs中的RIP3蛋白的表达水平,建立稳定干扰RIP3的原代乳鼠心肌细胞,分别给予PBS、Ang-II、PE处理24h;另一方面,在NRCMs中上调RIP3的表达水平,使RIP3过表达,然后分别给予PBS、Ang-II、PE处理24h。评估沉默或过表达RIP3后,乳鼠心肌细胞对Ang-II和PE诱导的心肌细胞肥大的反应。利用免疫荧光技术观察RIP3表达水平的变化对心肌细胞形态及表面积的影响,通过RT-q PCR观察ANP、β-MHC的m RNA表达水平的变化。2.将腺病毒载体导入SD雄性大鼠体内,使其过表达RIP3,并对大鼠进行随机编号,然后将其分为Sham组和AB手术模型组;另一方面,将RIP3特异性sh RNA重组腺相关病毒引入大鼠体内,从而降低大鼠心肌组织中RIP3的表达水平,然后将大鼠随机分为Sham组和AB手术模型组。观察各组大鼠的活力、饮食及饮水一般等情况。在手术后4周检测各组大鼠的体重（body weight,BW）、心脏重量（heart weight,HW）、肺重（lung weight,LW）及胫骨长度（tibia length,TL）。通过比较HW/BW（mg/g）、LW/BW（mg/g）、HW/TL（mg/mm）等指标来反映心肌组织肥厚的程度。测量心肌直径的大小,通过HE染色观察心肌组织结构的变化及心肌纤维化的程度。结果:1.sh-RIP3显著降低了乳鼠心肌细胞内源性RIP3蛋白的表达水平。在RIP3敲低的乳鼠心肌细胞中,心肌细胞的表面积明显小于scramble组。与scramble组相比,在Ang-II和PE处理后,sh-RIP3组心肌细胞表面积减小程度更为显著。与这些结果一致,在Ang-II和PE处理后,ANP和β-MHC的m RNA水平在RIP3敲低的原代乳鼠心肌细胞中表达下调。2.与对照组相比,RIP3在体外过表达明显增大了心肌细胞的表面积,且在Ang-II和PE刺激后,心肌细胞肥大程度更为显著。与此对应的,在RIP3过表达的乳鼠心肌细胞中,由Ang-II和PE刺激的ANP和β-MHC m RNA表达也更进一步上调。3.在过表达RIP3的大鼠中,主动脉缩窄手术组大鼠HW/BW、LW/BW、HW/TL等指标明显升高,但假手术组无明显变化。同时,组织学分析显示,过表达RIP3大鼠在主动脉缩窄术后4周,心肌横截面积、心脏直径及心肌组织纤维化程度和均显着大于对照组。这些结果表明,主动脉缩窄导致的大鼠心肌肥厚因RIP3的过表达而进一步加剧。4.主动脉缩窄手术4周后,sh-RIP3组大鼠的HW/BW、LW/BW、HW/TL等指标显著降低,而假手术组无明显变化。组织学分析显示,sh-RIP3大鼠主动脉缩窄手术后,心肌细胞纤维化横截面积和心脏直径明显小于sh RNA scramble和对照组大鼠。结论:1.RIP3是Ang-II和PE诱导体外心肌细胞肥大的发病机制所必需的。敲低RIP3可减轻体外诱导的心肌肥大,过表达RIP3在体外促进心肌细胞肥大。2.RIP3可能是心肌肥厚的重要调控靶点,在心肌组织中过表达RIP3似乎会加重但不会引发病理性心肌肥大。第三部分RIP3诱导心肌细胞肥大的信号通路研究目的:探讨RIP3是否通过与MLKL相互作用,使其易位至细胞膜,影响细胞内钙离子浓度,进而促进心肌肥厚的发展过程,阐明RIP3致心肌肥厚的信号通路机制。方法:1.CO-IP实验探索原代乳鼠心肌细胞中内源性RIP3是否可以与MLKL相互作用。2.使用WT和RIP3-/-H9c2细胞进行了细胞膜组分测定。用PE及Ang-II分别处理WT和RIP3-/-H9c2细胞24h,通过Western Blot观察WT和RIP3-/-H9c2膜组分和总细胞裂解物中RIP3、MLKL表达水平的变化,确定RIP3是否与MLKL相互作用并定位于细胞膜发挥作用。3.使用MLKL抗体进行免疫荧光以直接观察PE或Ang-II处理后其在WT和RIP3-/-H9c2细胞中的亚细胞定位改变。4.Fluo4染色确定WT和RIP3-/-H9c2细胞用PE或AngII处理后细胞内Ca2+浓度。5.利用慢病毒,使用靶向MLKL的sh RNA（shMLKL）修饰MLKL的表达以下调乳鼠心肌细胞的MLKL蛋白的表达水平,观察其对PE或Ang-II处理的心肌细胞表面积的影响。6.使用钙通道阻滞剂-氯化镧（lanthanum chloride,La Cl3）和钙释放激活钙通道抑制剂--2-氨基乙基联苯基硼酸酯（2-Aminoethoxydiphenyl borate,2-APB）来抑制钙离子内流,检测过表达RIP3大鼠在主动脉缩窄术后4周后HW/BW、LW/BW、HW/TL等指标的变化,并用HE染色观察心肌组织肥厚及纤维化程度。7.使用La Cl3和2-APB预处理WT和过表达RIP3的NRCMs,用PE、Ang-II和PBS刺激它们24h,通过免疫荧光染色观察PE或Ang-II刺激后心肌细胞肥大的程度。结果:1.MLKL作为RIP3底物,直接与内源性的RIP3相互作用,且其相互作用通过PE处理得到增强。2.PE或Ang-II刺激24h后,WT和RIP3-/-H9c2细胞裂解液中MLKL的蛋白水平没有差异,但RIP3-/-H9c2细胞膜上不存在MLKL表达,免疫荧光染色观察到与WT H9c2相比,RIP3-/-H9c2细胞中的MLKL蛋白从细胞膜表面脱离。3.在WT H9c2细胞中,PE或Ang-II处理24h后细胞内Ca2+浓度明显升高,而在RIP3-/-H9c2细胞中,PE或Ang-II处理后细胞内钙浓度显著低于野生型细胞。4.PE或Ang-II刺激乳鼠心肌细胞24h,敲低MLKL蛋白后很大程度上阻止了RIP3过表达诱导的细胞表面积增加。5.La CI3和2-APB治疗4周,术后HW/BW、LW/BW、HW/TL等指标显著低于PBS处理组。在过表达RIP3大鼠中,上述指标比未治疗组下降程度更为显著。组织学分析显示,与PBS处理相比,La CI3和2-APB治疗后心肌组织肥厚程度明显减轻。在过表达RIP3大鼠中,La Cl3及2-APB的治疗也很大程度上消除了因过表达RIP3加重的心肌肥厚的表型。6.免疫荧光结果显示PE或Ang-II刺激心肌细胞肥大,而过表达RIP3进一步增强心肌细胞肥大程度。有趣的是,在用La Cl3或2-APB处理后,过表达RIP3诱导的心肌细胞肥大程度明显减轻。结论:1.RIP3与MLKL相互作用形成复合物并定位于细胞膜上,促进了钙离子的内流。2.敲低MLKL蛋白后很大程度上阻止了RIP3过表达诱导的细胞表面积增加。MLKL是RIP3实现其生物学功能所必需的。3.阻断钙流入可逆转RIP3介导的心脏重塑恶化,表明钙内流在很大程度上介导了RIP3在心脏重塑中的有害作用。