论文部分内容阅读
Cathelicidins是包括人类在内的脊椎动物所特有的宿主防御肽，是构成脊椎动物自然免疫的关键组分，在宿主抗感染及免疫调节方面发挥重要作用，是连接自然免疫和特异性免疫的桥梁，该基因的缺失或异常表达都将导致严重疾病的发生。本研究首次从鸟纲鸽形目原鸽(Columba livia)的法氏囊cDNA文库中，通过RACE-PCR克隆得到两条cathelicidins的编码基因，其开放阅读框(ORF)大小分别为471bp和450bp，均由N端信号肽区域、中间保守cathelin区域和C端成熟肽区域构成，编码的成熟肽根据结构特征分别命名为 C1-CATH2(LIQRGRFGRFLGRIRRFRPRINFDIRARGSIRLG，34aa)和C1-CATH3(RVKRFWPLVPVAINTVAAGINLYKAI KRK,29aa)。组织表达谱分析结果显示C1-CATH2和3都具有广泛的组织分布，但表达谱差异显著。C1-CATH2在脾脏、肺、法氏囊和肝脏的表达量均高于C1-CATH3，而C1-CATH3在肾脏和心脏的表达量高于前者。 通过单纯鸟纲及多纲物种的cathelicidins序列比对发现与由多重基因复制导致的哺乳纲cathelicidins的高度差异性不同，鸟纲cathelicidins家族中除最古老的B1家族外，其余家族序列包括成熟肽区域在内均极度保守。随后进行的系统进化树分析和同义突变率（Ks）与非同义突变率(Ka)比值Ka/Ks计算进一步证明鸟纲cathelicidins各家族与B1，CATH1/3与CATH2间呈进化阳性选择。这种选择推进鸟类cathelicidins向序列更短，活性更强的家族进化。同时证明了CATH1和CATH3家族序列存在高度的进化趋同性，揭示了CATH1和CATH3基因家族可能起源于同一个基因的多拷贝变异。 由于CATH2家族是鸟纲物种表达最丰富的cathelicidins家族，但其in vitro抗菌活性却弱于其他家族，我们推测它可能通过对鸟类免疫系统的调节作用间接发挥防御功能.于是我们进一步验证了C1-CATH2对免疫系统的调节作用。结果显示C1-CATH2可以从mRNA及蛋白水平均显著下调LPS激活的小鼠巨噬细胞RAW264.7中诱导型NO合酶、肿瘤坏死因子（TNF-α)，白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)等致炎细胞因子水平，但却选择性提高抗炎细胞因子白介素-10(IL-10)的表达水平。进一步我们利用圆二色谱(Circular Dichroism, CD)与Rosetta(version3.5)建模获得了C1-CATH2的高级结构，显示C1-CATH2具有高比例的α-螺旋，与其他许多正电荷两亲性的宿主防御肽家族一致，这种结构特征有利于与靶细胞结合并嵌入，最终破坏其形态结构的完整性。通过分子对接(Molecular Docking)验证，辅助免疫印迹（western blotting）实验对C1-CATH2免疫调节机理进行了研究。结果揭示了C1-CATH2通过调节TLR4受体通路，继而影响下游的MAPK通路(p38，JNK1/2，ERK1/2)磷酸化水平，并最终影响转录因子蛋白家族NF-κB的核定位来调控各炎症因子水平。同时，我们于国内外首次阐明了cathelicidin与TLR4-MD-2膜受体复合物的相互作用方式:通过结合于复合物中的MD-2口袋边缘区域，以空间位阻方式阻碍LPS进入口袋，进而干扰了LPS诱导引起的TLR4-MD-2复合物的二聚化而最终抑制了TLR4通路激活。