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菌蜕(Bacterial ghosts,BGs)是通过克隆的PhiX174噬菌体溶菌基因E的可调控表达而形成的、缺少细胞浆和核酸的、无繁殖能力的革兰氏阴性细菌菌体。克隆在质粒上的PhiX 174噬菌体的E基因在大肠杆菌中表达后通过寡聚化可形成一跨膜孔道,导致宿主菌细胞内容物外流而溶菌形成菌蜕。这种由E基因介导制备的菌蜕实际上是在非变性条件下灭活了的细菌菌体,与至今仍在使用的传统的变性灭活菌苗相比,菌蜕完好地保留了细菌菌体的各种抗原结构,没有任何免疫原性的改变,因此是一种优良的候选灭活菌体疫苗。本课题在常规的质粒依赖型菌蜕的研究基础上,研究构建了非质粒依赖型菌蜕菌株。与质粒依赖型相比,这种非质粒依赖型菌蜕菌株可避免由于溶菌质粒的丢失而导致的溶菌效率降低,同时不需要抗生素进行筛选,为菌蜕疫苗的制备缩减了成本,且可避免造成抗生素的耐用,因此具有更大的应用潜力。中药具有不良反应少、毒副作用小和无依赖性等特点,且对机体的免疫系统具有多方面的重要调节作用。本课题以此为着眼点,将中药复方玉屏风散制备成玉屏风注射液,作为菌蜕疫苗的免疫佐剂,进行实验动物(鸡)的免疫试验,对免疫效果进行评定。主要研究内容包括:1.质粒pTLacZ:LC的构建以禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)野毒株RC-123为研究材料,PCR扩增出其基因组DNA中的LacZ基因,通过TA克隆构建质粒pTLacZ。从广宿主溶菌质粒pBBRlys上扩增E基因溶菌表达盒(lysis cassette,LC),TA克隆构建质粒p-T-LC。p-T-LC与pTLacZ经相同限制性内切酶BssHⅡ酶切后,可得到LC片段和从LacZ基因内切开的线性化pTLacZ,再经连接酶将二者连接,即可构建成LC位于LacZ基因中的质粒pTLacZ:LC。2.非质粒依赖型菌蜕菌株的构建从质粒pTLacZ:LC中PCR扩增出LacZ:LC等位基因片段,电击转化入RC-123电转感受态细胞中。等位基因片段LacZ:LC与RC-123基因组DNA以LacZ基因两端为同源臂,发生双交换同源重组突变,溶菌表达盒LC插入RC-123基因组的LacZ基因中并使LacZ基因失活,在筛选培养基上呈白色菌落,即为RC-123的非质粒依赖型菌蜕疫苗菌株RC-123(LC)。3.溶菌动力学试验将RC-123(LC)于28℃培养至OD600nm约为0.4,迅速提高培养温度至42℃进行温度诱导溶菌。诱导开始后60～75min之间开始出现溶菌,约两小时诱导基本完成。溶菌前后的培养物CFU从1.02×10~8(cfu/ml)下降到8.16×10~2,溶菌灭活效率达到99.9992%,略高于质粒依赖型菌蜕菌株RC-123(pBBRlys)。4.玉屏风注射液的制备按中药复方玉屏风散的比例称取黄芪、白术、防风三味中药材,采用水醇法制备成玉屏风注射液(1g/ml)。玉屏风注射液为棕红色至棕褐色澄清液体,PH值为4.0～5.5,符合药典要求。给7日龄健康雏鸡肌肉注射玉屏风注射液0.8mL/只(相当于4倍注射用量),雏鸡的精神、采食、排便情况均无异常,证明玉屏风注射液具有安全性。5.免疫保护试验将RC-123(LC)菌蜕疫苗和传统的RC-123甲醛灭活苗分别免疫健康雏鸡,比较免疫保护效果。同时,将玉屏风注射液作为菌蜕疫苗佐剂,设置了两组玉屏风佐剂的应用方案,即佐剂Ⅰ组于接种前一天及接种时各注射1次、佐剂Ⅱ组仅接种当日与菌蜕疫苗同时肌肉注射1次,对各组的免疫效力进行比较。结果表明,RC-123(LC)菌蜕疫苗组鸡只(C组)对同源株攻毒的相对保护率为77.78%,稍高于RC-123(LC)甲醛灭活苗组(64.89%),而且发病时间有所推迟;菌蜕疫苗玉屏风佐剂Ⅰ、Ⅱ组均高于菌蜕疫苗无佐剂组,玉屏风佐剂Ⅰ组(88.89%)又高于佐剂Ⅱ组(83.33%)。试验结果初步证实RC-123(LC)菌蜕疫苗的免疫效力略高于传统灭活菌苗的水平,此外,玉屏风注射液作为菌蜕疫苗的佐剂可提高菌蜕疫苗的免疫保护率。