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工业焦化废水中含有大量的有毒有害物质，它们对环境和人体的危害很大。目前比较有效的处理工业焦化废水的方法是生物法处理，即通过微生物的代谢将这些有毒有害物质降解去除。目前虽然已经发展出许多种生物处理工艺，如活性污泥法，厌氧-缺氧-好氧生物膜法等，并在实际工业中运行，但很多时候得不到一个比较好的处理效果。其中很重要的一个原因是我们对工业焦化废水处理系统的活性污泥或生物膜中的微生物群落里各微生物种群及它们各自在处理系统中所起的降解功能没有一个详细正确的了解。以前对这些微生物群落中的降解功能微生物的研究主要是通过分离培养的方法。然而，越来越多的研究表明，能培养的微生物只占自然环境中的很少一部分。大部分微生物都是难培养或不可培养的。
为了能够正确了解工业焦化废水处理系统中的微生物群落结构及其中各微生物种群的功能，本研究采用了各种微生物分子生态学的方法，系统地对工业焦化废水处理系统中的微生物群落结构、苯酚降解相关基因的多样性和从该系统中分离到的苯酚降解菌进行了详细的分子分析，并对微生物分子生态学中的某些关键方法进行了优化。具体内容主要包括四部分。
第一部分是优化活性污泥16SrRNA基因温度梯度凝胶电泳(temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE)图谱中单一条带序列分析的方法。对每条带通过克隆文库组成分析和单个克隆的电泳行为分析发现，由于在PCR扩增过程中形成的单链DNA污染，TGGE图谱中每个单一条带的序列多样性都被大大高估了。我们对比了3种去除单链DNA的方法，它们分别是绿豆芽核酸酶消化法、PCR扩增程序的优化和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(denaturedpolyacrylamidegelelectrophoresis，d-PAGE)纯化法。其中d-PAGE纯化法是最有效的。该方法可以将单链DNA消减到几乎检测不到的水平。另外，结合每个单一TGGE条带的序列和条带强度的分析后，我们还研究了该活性污泥系统中的优势细菌组成。我们只检测到了beta和alpha变形菌纲，它们分别占总优势细菌的93.8﹪和6.2﹪。该工作表明为了得到单一TGGE条带的真实序列信息，最好先将单链DNA消减到几乎检测不到的水平，然后再构建克隆文库对其分析。
第二部分是研究活性污泥系统中分离出的苯酚降解菌Alcaligenes的苯酚羟化酶基因的微多样性。我们从太原某焦化废水处理厂的活性污泥样品中分离到97个苯酚降解分离物，它们具有相同的ARDRA图谱。根据ERIC-PCR指纹图谱将这97个分离物分为6种类型，每种类型代表分离物的16SrRNA基因两两之间的相似性大于99.47﹪。97个分离物的苯酚羟化酶大亚基基因(thelargestsubunitofthemulti-componentphenolhydroxylase，LmPH)的PCR扩增、TGGE指纹图谱及测序分析表明，每个ERIC-PCR类型中的分离物有相同的LmPH基因序列。在这6种不同的ERIC-PCR类型中，有两种类型的分离物带有2个不同的LmPH基因，分别编码低亲和常数(low-Ks)和高亲和常数(high-Ks)的苯酚羟化酶。有3种ERIC-PCR类型的分离物只带有高亲和常数的LmPH基因。另外1种ERIC-PCR类型的分离物没有扩增出LmPH基因。该工作表明苯酚降解菌的系统进化分类地位和它们的LmPH基因型之间没有对应关系，这可能是由于该功能基因的广泛的基因水平转移所致。
第三部分是研究上海焦化废水处理厂接触氧化池中降酚菌群的LmPH基因多样性。通过TGGE指纹图谱对比分析了氧化池4个区段(01-04)中降酚菌群LmPH的组成。它们的TGGE图谱完全一样，相似性为100﹪，表明该处理池中不同区段的微生物种群的功能基因组成是高度相似的。以04段的菌群为代表建立LmPH基因克隆文库。序列分析结果表明，测序的49个克隆被分为16种类型，其中优势LmPH基因主要有5种类型(多于4个克隆)，而另外11种类型都只有1个克隆。基于氨基酸序列的系统进化树分析表明，LmPH文库中绝大部分的类型都属于低亲和常数的LmPH，占所有克隆的92﹪。只有1个类型属于高亲和常数的。该工作表明处理焦化废水的工业装置中不仅具有丰富多样的苯酚羟化酶基因类型，而且以编码低亲和常数的占优势地位，而过去报道的通过富集培养分离得到的降酚菌则多带有高亲和常数的苯酚羟化酶。这提示我们传统的富集培养方法并不能筛选到生态环境中的真正优势功能菌。
第四部分主要是对比研究了工业焦化废水实验室模拟处理装置的厌氧池(A1)、缺氧池(A2)和氧化池(01)中的LmPH基因的多样性和丰度。通过PCR-DGGE分析了这3个具有不同运行条件的处理池中的LmPH基因组成。A2和01池的DGGE图谱完全一样，有7个条带；A1的DGGE图谱中有5个条带，其中的4个条带和A2、01中的一样。它们之间的相似性系数为66.7﹪。实时荧光定量PCR结果表明，LmPH基因在A1、A2和01池中的拷贝数相差不多，在一个数量级上。三个池样品的每纳克微生物基因组DNA中分别有3.9x104、2.1x104和3.3x104个拷贝的LmPH基因。该工作表明，在厌氧条件下，好氧代谢途径的苯酚羟化酶基因也可以有很高的丰度和多样性。总结：本课题对工业焦化废水处理系统中的微生物群落及降解功能基因多样性进行了详细的微生物分子生态学研究。主要的研究发现有四点：
1.单链DNA污染会造成对TGGE图谱单一条带序列多样性的高估，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(d-PAGE)纯化的方法可以将单链DNA污染削减到几乎检测不到的水平。该方法可以更准确地获得TGGE图谱单一条带中的真实序列信息。另外，工业焦化废水处理系统活性污泥中的优势微生物种群是beta变形菌纲。
2.在苯酚羟化酶基因中存在微多样性现象，甚至在一个苯酚降解菌中可以同时具有两种不同降解动力学类型的苯酚羟化酶基因。这表明苯酚降解菌的系统进化分类和它们的苯酚羟化酶基因之间可能没有对应关系，因此该基因可能不适合用于分析苯酚降解菌的系统进化分类。
3.低亲和常数的苯酚羟化酶基因类型是工业焦化废水处理系统中的优势类型，而一般传统富集培养方法分离到的却是高亲和常数的类型。这表明传统富集培养方法并不能分离筛选到生态环境中的真正优势功能菌。
4.苯酚羟化酶基因在厌氧条件下也有很高的丰度和多样性。这表明在好氧条件下才表达的降解功能基因在厌氧条件下也可能有广泛的分布。