急性肝功能衰竭是临床常见危重症，一直以来无肯定有效的治疗措施，病死率居高不下，维持在60%-80%。原位肝移植被认为是肝衰竭最佳的治疗手段，但因供肝来源少、成本高、手术复杂、术后需长期免疫抑制治疗促使人们寻找更适宜的方法。肝细胞移植作为器官移植的替代治疗，已经证实在治疗肝衰竭及代谢缺乏性肝脏疾病方面显示出良好的疗效。但是异种或异体肝细胞移植后免疫排斥反应是肝细胞移植失败的首要原因。其次肝细胞体外存活时间短，不能大量增殖及传代。在这种情况下，研究者致力于干细胞的移植治疗以期望克服这些不足。近年来间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植已成为治疗急性肝功能衰竭的新兴治疗手段。干细胞能自我复制且具有多向分化潜能，在适宜的条件下能分化成需要的细胞并具有相应功能。更重要的是，MSCs与胚胎干细胞比较，更符合伦理要求，具有免疫调节功能，体外能大量增殖且增殖速度快。在MSCs的众多组织来源中，脂肪来源的间充质干细胞(AMSCs)具有来源丰富，免疫原性低等优势，有可能成为治疗终末期肝病最佳的细胞来源，但治疗的时效性、安全性和潜在的疗效还需进一步证实。由于单独的MSCs或肝细胞移植治疗的局限性限制了下一步的研究，因此我们设想是否能采取联合移植的方法，起到两种细胞在细胞功能、免疫调节等方面相互协同作用，从而避免单独移植的局限性。为此，本实验首先分离人不同部位来源(包括眼袋、皮下)脂肪组织来源的间充质干细胞(human adipose derived mesenchymla stem clells,hAMSCs)和鼠肝细胞，将分离的MSCs行表面分子标志鉴定以及成骨成脂诱导，并对不同部位来源的hAMSCs行生物活性比较；其次体外在肝衰竭病人血清(hepatic failure serum HFS)刺激下，将两种细胞以不同比例分别行间接或直接共培养，以及在无血清刺激下长期间接共培养，从细胞因子水平、基因表达、细胞功能等多方面探讨两种细胞的相互作用及可能的作用途径；最后将脂肪间充质干细胞（adipose derived mesenchymal stem cell,AMSCs）用菲立磁标记后，与肝细胞联合移植急性肝损伤大鼠模型，证实联合移植的有效性及优越性。本实验主要的研究结果如下：1、采用Ⅳ型胶原酶消化法获得了大量、稳定、快速分离不同部位组织(包括皮下、眼袋) hAMSCs的方法。流式细胞仪表面分子鉴定提示分离的细胞具有MSCs的表型特征，而不表达造血干细胞或上皮细胞的标志物。分离的细胞具有成骨、成脂诱导分化潜能。比较了两个不同部位(皮下、眼袋)来源的单位质量脂肪组织间充质干细胞获得数量，细胞贴壁率，细胞曲线以及衰老相关性β-半乳糖苷酶染色，证实了单位质量眼袋脂肪组织获得的干细胞数量及细胞贴壁率高于皮下脂肪组织，但是在细胞衰老、细胞生长速率方面没有差别。2、hAMSCs与鼠肝细胞分别以(1:5、1:10、1:20、1:50)四个不同比例直接混合培养，加入HFS刺激72h与肝细胞单独培养比较。结果表明混合培养组能减轻HFS对肝细胞的毒性刺激，且最适宜的混合比例是1:10。证实了hAMSCs具有保护HFS对肝细胞毒性损伤的作用。hAMSCs与肝细胞以1:10比例间接混合培养，加入HFS72h，收集培养上清液测定细胞因子水平和肝功能，并对间接培养组上层间充质干细胞行基因表达检测。在测定细胞因子中，只有IL-6水平明显增高。加入IL-6抗体后，细胞存活率、肝细胞分泌的白蛋白及尿素氮水平明显下降。提示IL-6是对肝细胞具有保护作用的重要细胞因子。RT-PCR和细胞功能检测显示共培养上层hAMSCs在血清刺激72h内不表达肝细胞特异性基因，也不具有肝细胞的代谢功能。而hAMSCs和鼠肝细胞在无肝衰竭血清刺激下长期体外混合培养,从第7天开始间充质干细胞分化为肝细胞样细胞，并具有肝细胞形态和功能。提示hAMSCs对肝细胞的保护作用在肝衰竭血清作用初期是通过免疫调节实现的，而不是通过转分化作用。3、用普鲁士蓝染色SPIO标记hAMSCs，可见标记细胞胞质内含有多少不等的蓝染铁颗粒，且细胞活力、生长能力、增殖功能没有受到影响，显示SPIO成功标记hAMSCs。从尾静脉、股静脉、门静脉三种途径移植SPIO标记的hAMSCs治疗CCl4诱导的急性肝损伤大鼠模型。移植7天后大鼠的一般情况好转，肝功能、肝组织改善显著，但是三种途径间疗效没有明显统计学差异。移植后血清细胞因子水平IL-6,IL-10,IFN-γ较对照组均有明显增高，p﹤0.05，提示免疫调节作用可能是hAMSCs治疗急性肝损伤的机制之一。hAMSCs与肝细胞联合移植与hAMSCs、肝细胞单独移植做比较，hAMSCs与肝细胞联合移植治疗是可行的，并且在肝功能改善、肝脏组织修复方面优于hAMSCs或肝细胞单独移植。总之，本研究在成功分离hAMSCs的基础上，对人两个不同部位AMSCs的生物学特性进行了较深入的研究，从细胞因子水平、肝功能、基因表达等方面探讨了hAMSCs和肝细胞间的相互作用。证实了hAMSCs具有保护肝细胞免受炎症损伤的作用，其中免疫调节起着关键作用，在细胞因子中IL-6是肝细胞重要的保护性因子，最后证实了hAMSCs和肝细胞联合移植治疗急性肝损伤的优势性。而且尾静脉、股静脉、门静脉三种移植途径均是hAMSCs修复肝损伤的有效途径。本研究为干细胞移植治疗急性肝损伤提供较为丰富的实验依据以及新的移植思路。