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五子衍宗方(WZYZ)是我国临床上常用的经典古方,具有补肾益精的功效,主要用于治疗肾虚精亏所致的阳痿不育、遗精早泄、腰痛、尿后余沥等症。目前,国内外对WZYZ的研究主要集中在药理作用及临床应用两个方面,而对于其中化学成分的研究主要集中在丸剂和片剂单一成分或几个主要有效成分的定性以及定量,而对于复方全面的化学物质成分研究还不够透彻,从而在一定程度上限制了WZYZ的应用和发展。因此,本文拟采用液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)及超高效液相色谱-飞行时间质谱(Ultra-high performance liquid chromatography quadrupole-time-of-flight mass spectrometry,UHPLC-Q-TOF-MS)联用技术对WZYZ化学成分进行整体全面的分析,初步探索其化学物质基础。五味子作为WZYZ的组方药材,具有收敛固涩,益气生津,补肾宁心的功效,主要用于治疗久嗽虚喘,梦遗滑精,遗尿尿频,久泻不止,自汗盗汗,津伤口渴,内热消渴,心悸失眠等症。五味子中主要活性成分为木脂素类化合物,该类成分不仅对肾脏、肝脏和生殖系统疾病均具有一定的治疗效果,同时具有抗菌、增强免疫、抗肿瘤、抗人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)等药理作用。目前,已有相关文献研究报道了木脂素类成分的体内代谢过程及少量相关代谢产物,但对其体内代谢产物分析研究还有待深入,以明确其体内发挥药效的物质组成。因此,本实验拟采用UHPLC-Q-TOF-MS联用技术对五味子主要木脂素类成分的体内代谢产物进行研究,进一步阐述其发挥药效的物质基础。第一部分五子衍宗方HPLC指纹图谱研究目的:建立WZYZ的HPLC指纹图谱,对其中的特征峰进行指认并建立共有峰模式,将复方与单味药材进行峰匹配研究,对复方中的化学成分进行来源归属。方法:采用HPLC-DAD检测法,色谱柱为Waters Symmetry?C18(250mm×4.6 mm,5μm),流动相为0.4%磷酸水溶液-乙腈,体积流量为1.0 m L/min,线性梯度洗脱,柱温为35℃,检测波长为254 nm,对12个批次的WZYZ样品进行HPLC指纹图谱相似性评价,并将WZYZ对照图谱与单味药材进行谱峰匹配。结果:12批WZYZ样品色谱图中共标定共有峰24个,指认的特征峰有8个,分别为没食子酸(1)、京尼平苷酸(4)、绿原酸(8)、金丝桃苷(19)、异槲皮苷(20)、毛蕊花糖苷(21)、山柰酚-3-O-云香糖苷(22)、异毛蕊花糖苷(23);单味药材色谱峰与WZYZ谱峰共有峰匹配数分别为枸杞子8个、炒菟丝子10个、覆盆子7个、车前子3个、五味子1个。各批WZYZ样品之间的相似度均大于0.959,各批WZYZ样品与对照指纹图谱之间的相似度均大于0.979。结论:建立的WZYZ指纹图谱相似度较高,同时结合制剂用药材与WZYZ制剂指纹图谱谱峰匹配相结合的方法为WZYZ的定量、定性鉴别提供了科学、简便可行的评定方法。第二部分UHPLC-Q-TOF-MS法分析鉴定五子衍宗方中117种化学成分目的:应用UHPLC-Q-TOF-MS技术在正、负离子模式下分离分析WZYZ中化学成分。方法:Thermo Accucore C18(150 mm×2.1 mm,2.6μm)色谱柱,以0.1%乙酸-2 mmo L/L乙酸铵-水(A相)-乙腈(B相)为流动相,分别在正、负离子模式下进行梯度洗脱,流速0.4 m L/min,进样量0.2μL。通过正、负离子质谱信息,元素组成以及与对照品比对或文献中化合物的保留时间和质谱参数等分析其化合物的结构信息,并对复方样品中化合物进行来源归属。结果:结合UHPLC-Q-TOF-MS提供的化合物准确相对分子质量,在复方样品中共鉴定了117个化学成分,其中黄酮类化合物27个,苯丙素类化合物46个,萜类化合物17个,有机酸类化合物22个,还有其他成分5个;117个成分中共计有18个成分来自于枸杞子,17个成分来自于炒菟丝子,40个成分来自于覆盆子,31个成分来自于盐车前子,38个成分来自于蒸五味子。结论:该研究建立了WZYZ化学成分的鉴定方法,初步阐明了其化学成分组成,为阐明其药效物质基础提供了参考。第三部分UHPLC-Q-TOF-MS法鉴定大鼠口服五味子提取物后主要成分的体内代谢产物目的:鉴定大鼠口服五味子提取物后进入体内的活性成分及6种主要成分(Schizandrin A、Schisandrol A、Schizandrin B、Schisandrol B、Schizandrin C、Schisantherin A)在血浆、尿液和胆汁中的代谢产物。方法:按12 g/kg剂量对SD大鼠灌胃五味子提取物后,收集不同时间点的血浆、胆汁和尿液。采用UHPLC-Q-TOF-MS对各样品进行检测,分析各样品中的原型成分及6种主要活性成分的代谢产物。色谱柱为Thermo Accucore C18(150 mm×2.1 mm,2.6μm),柱温为40℃,流动相为0.1%乙酸-2 mmo L/L乙酸铵-水(A相)-乙腈(B相),流速为0.4 m L/min,进样量为4μL,梯度洗脱。结果:从大鼠血浆、尿液和胆汁样品中共鉴定木脂素类原型化合物共33个,6种主要活性成分的代谢产物共149个(I相代谢产物130个,II相代谢产物19个)。通过对推测的代谢产物结构进行查新,其中新发现的代谢产物有75个。结论:本实深入研究了五味子提取物的体内代谢研究,对其主要成分可能的裂解规律进行了推测,为五味子的药理学和临床应用研究提供了一定的依据。