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目的:1.制定体外hiPSC-EC定向诱导分化方案,检测分化过程中miR-199b-5p转录水平;2.验证hiPSC-EC中miR-199b-5p的分泌方式及其对HUVEC增殖、迁移、成管等细胞功能的影响;3.研究hiPSC-EC-Exo影响HUVEC细胞功能的分子生物学机制;4.研究hiPSC-EC-Exo促进小鼠缺血下肢血管新生的作用及机制。方法:1.制定诱导分化条件,进行体外hiPSC-EC分化,免疫磁珠分选系统（MACs）筛选CD31+EC细胞,流式细胞术及细胞免疫荧光术鉴定EC纯度,实时荧光定量PCR检测分化不同阶段细胞内的miR-199b-5p转录水平;2.构建miR-199b-5p过表达、抑制、阴性对照慢病毒载体分别转染HUVEC细胞并行体外细胞功能学实验。超速离心法细胞上清中的外泌体（hiPSC-EC-Exo、inhibit-miR199b-5p-Exo）,透射电镜（TEM）、Western Blot、Nanosight鉴定外泌体粒径、标志物及浓度,外泌体PKH26染色并与HUVEC体外共培养,q PCR验证HUVEC内mir-199b-5p转录水平;共培养时同时进行细胞功能学实验;3.q PCR检测血管新生相关靶基因,探讨可能的靶基因位点,Western blot检测外泌体共培养及慢病毒转染后的HUVEC细胞血管新生相关信号通路Jagged1/Notch1活化水平;4.构建下肢动脉缺血模型,随机分为4组（假手术组、阳性对照组、hiPSC-EC-Exo注射组、inhibit-miR199b-5p-Exo注射组）,每组10只小鼠。术前、术后、术后7天、14天、21天行激光散斑成像评估缺血侧及健侧下肢血流灌注情况。取21天缺血侧下肢肌肉组织,行免疫组化检测毛细血管密度。结果:1.成功实现hiPSC-EC,通过MACs纯化后,流式细胞术及细胞免疫荧光鉴定CD31阳性率可达80%以上。q PCR实验结果显示,miR-199b-5p转录水平随分化时间增加逐渐上调。分化第7天,miR-199b-5p转录水平为内参基因U6的4.896±0.2937倍,p<0.05;分化第10天,miR-199b-5p转录水平为内参基因U6的10.70±0.8269倍,p<0.05;2.hiPSC-EC通过外泌体形式分泌miR-199b-5p。miR-199b-5p可直接促进细胞迁移、增殖及成管。电镜下hiPSC-EC-Exo及inhibit-miR199b-5p-Exo呈典型“茶杯状”,直径约在40-100nm,浓度约1*1010/ml,均表达外泌体表面标志物:CD9,CD63,TSG101。外泌体共培养反向验证hiPSC-EC-Exo通过miR-199b-5p增强HUVEC迁移、增殖和成管能力。;3.q-PCR显示miR-199b-5p过表达后VEGFR2转录水平较对照组明显升高（3.792±0.3212 vs 1.080±0.09560,p<0.05）,其余血管新生相关基因无明显差异,mir-199b-5p过表达组Jagged1、NICD、HES1蛋白表达水平较对照组下降,VEGFR2蛋白表达上调。外泌体共培养实验证实,hiPSC-EC-Exo组Jagged1、NICD、HES1蛋白表达水平较对照组下降,VEGFR2蛋白表达上调;4.术后第14天hiPSC-EC-Exo注射组小鼠缺血下肢较对照组血流灌注增加（0.236±0.035 vs 0.370±0.030,p<0.05）,术后第21天hiPSC-EC-Exo注射组较对照组血流灌注增加（0.181±0.015 vs 0.505±0.045,p<0.05）,inhibit-miR199b-5p-Exo注射组与对照组相比无明显差异;免疫组化结果显示术后21天,hiPSC-EC-Exo注射组毛细血管数量较对照组增加（272.3±26.03,p<0.05）,inhibit-miR199b-5p-Exo注射组与对照组相比无明显差异。结论:1.改良人诱导多能干细胞-血管内皮细胞（hiPSC-EC）诱导分化方案明显提高EC细胞获得率,分化过程中miR-199b-5p转录水平明显升高;2.hiPSC-EC上清中的外泌体（hiPSC-EC-Exo）高表达miR-199b-5p,增强HUVEC细胞增殖、迁移、成管能力;3.hiPSC-EC-Exo中高表达的miR-199b-5p抑制HUVEC内Jagged1/Notch1通路,促进VEGFR2表达;4.hiPSC-EC-Exo中高表达的miR-199b-5p提高缺血患肢血流灌注,促进小鼠缺血下肢血管新生。