论文部分内容阅读
阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是一种多发于老年人的中枢神经系统退行性疾病,是痴呆最常见的病因,发病率呈快速增长趋势。中国脑计划已经将AD列为重要关注的三大神经和精神疾病之一。AD发病的危险因素多样化,机制复杂化,尚不明确,为其治疗带来巨大困难。目前AD临床治疗药物仅能减轻症状,不能延缓或终止病理进程,并且有较多的不良反应。因此,AD的新药研发迫在眉睫。从天然产物中发现新药具有巨大的潜力。目前研究显示有多种芪类化合物具有潜在的抗AD作用。木豆素(cajaninstilbeneacid,CSA)是从木豆[Cajanusc cajan(L.)Millsp.]叶中提取的一种活性芪类化合物,具有神经保护等作用。因此推测CSA有可能成为治疗AD的候选药物。在新药研发过程中,药物代谢动力学研究可以对候选药物的动力学特征进行早期评价,提高新药研发成功率,降低成本和风险,获得最有效的治疗药物。目前国内外没有关于CSA改善学习记忆的研究报道,其药物代谢动力学方面仅有两篇文献研究。因此,本研究拟采用不同的动物模型对CSA在学习记忆方面的药理作用进行评价,然后从多个层面揭示其作用机制,最后在整体动物以及细胞水平探讨其体内动力学过程和吸收转运机制。完成的研究内容主要有以下三个方面:1.木豆素改善学习记忆障碍的药理作用研究首先建立Aβ寡聚体所致小鼠学习记忆障碍的模型,然后采用建立的Aβ寡聚体脑内注射模型以及慢性睡眠剥夺模型,通过空场、物体位置识别、水迷宫和避暗行为学检测方法评价CSA对模型动物学习记忆障碍的药理作用。结果表明,海马CA1区双侧注射Aβ1-42寡聚体(100pmol/只)可以成功建立学习记忆障碍模型;在Aβ寡聚体脑内注射模型和慢性睡眠剥夺模型中,灌胃给予CSA(7.5、15和30mg/kg)不影响模型小鼠的自主活动,可以改善模型小鼠对物体位置的短期辨别记忆能力,提高水迷宫实验中的学习和记忆能力,增强模型小鼠在避暗实验中获得和保持被动回避能力。2.木豆素改善学习记忆障碍的作用机制研究首先建立测定小鼠血清和海马组织中色氨酸(tryptophan,Trp)及其代谢产物(犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、3-羟基犬尿氨酸、5-羟色胺和5-羟吲哚乙酸)、谷氨酸(glutamicacid,Glu)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)含量的液相色谱串联质谱分析方法,然后从多个层面研究CSA改善Aβ寡聚体所致小鼠学习记忆障碍的机制,主要包括:采用尼氏染色和免疫荧光染色方法监测神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的状态以及海马内Aβ的含量;采用建立的分析方法测定Trp及其代谢产物、Glu和GABA的含量;采用Western blot方法测定GluN1和GluN2B受体以及下游PKA/CREB/BDNF/TrkB信号通路的表达水平。结果表明,建立的分析方法具有良好的专属性、线性、灵敏度和稳定性,可用于比较不同实验组动物体内各待测物含量的差异;CSA改善Aβ1-42寡聚体诱导的学习记忆障碍可能是通过清除海马中Aβ,抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的活化,维持Trp代谢的正常水平,逆转Glu和GABA水平失调,抑制GluN2B过度表达和上调PKA/CREB/BDNF/TrkB信号通路等发挥作用。3.木豆素的药物代谢动力学研究首先鉴定大鼠体内CSA的主要代谢产物并建立生物样品分析方法,然后采用建立的分析方法研究CSA及其主要代谢产物在大鼠体内的药代动力学特性和排泄途径,最后基于Caco-2细胞模型研究CSA的肠道吸收转运机制。结果表明,血浆、胆汁和尿液中主要存在五种CSA代谢产物(M1-M5),分别为CSA-3-O-glucuronide、CSA-2-COO-glucuronide、6,12-dihydroxy CSA、3-hydroxy-5-methoxystilbene-3-O-glucuronide和6-hydroxy CSA-3-O-glucuronide,说明葡萄糖醛酸化和氧化反应是其主要代谢途径;建立的分析方法具有良好的专属性、线性、灵敏度、精密度、准确度和稳定性,可用于CSA的体内药代动力学研究;CSA口服吸收迅速,生物利用度为44.36%,首过效应使CSA转化成大量的CSA-3-O-glucuronide限制其吸收,CSA的肝肠循环、组织分布和肾脏重吸收等药代动力学特性延缓其体内消除过程,延长作用时间;CSA及其代谢产物M1-M5以胆汁排泄为主,总排泄量约占给药量的78%,CSA以原型形式从胆汁和尿液中排泄的总量约占给药量的0.6%,而M1-M5的总排泄率为81%,说明CSA在体内被广泛代谢,生成大量的代谢产物;CSA在Caco-2细胞模型中以跨细胞膜途径的被动扩散方式进行转运,吸收良好。综上所述,CSA在不同动物模型中均表现出改善学习记忆障碍的药理作用;其作用机制可能与清除海马中Aβ,抑制胶质细胞活化,维持Trp代谢正常水平,逆转Glu和GABA水平失调,抑制GluN2B过度表达和上调PKA/CREB/BDNF/TrkB信号通路等有关;CSA 口服时以被动扩散方式迅速吸收,缓慢消除,存在首过效应、肝肠循环、组织分布和肾脏重吸收等药代动力学特性,主要代谢途径为葡萄糖醛酸化和氧化反应,以胆汁排泄为主。本研究有助于了解CSA改善学习记忆障碍的药理作用及其药物代谢动力学规律,为其在治疗AD方面的新药研发奠定基础,并为甚类化合物的开发利用提供参考。