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目的:糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病的常见并发症之一,可发生肾小管上皮细胞间充质转分化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT),最终发展为肾纤维化。肾小管上皮细胞EMT在肾脏纤维化进程中具有关键性作用,被认为是肾纤维化进程启动的标志。多种因素可以导致糖尿病肾病肾纤维化的发生,如糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGES)、线粒体功能紊乱、自噬功能紊乱、炎症通路的激活等,但具体机制仍不清楚。人白细胞分化抗原36(Cluster of Differentiation 36,CD36)是一种跨膜糖蛋白分子,在长链脂肪酸的跨膜转运及代谢性炎症的发生中起着重要作用。研究发现,CD36可介导多种原因导致的肾脏损伤,加速肾脏疾病的进展。CD36的生物学功能主要受其翻译后棕榈酰化修饰调节。本课题旨在研究糖基化终末产物是否能通过调节CD36棕榈酰化,影响肾小管上皮细胞间充质转分化,从而启动糖尿病肾病肾纤维化进程,并且探讨其可能的分子机制。方法:第一部分:采用10只C57BL/6J背景的野生型小鼠为动物模型,随机分为正常对照组(CON组)、糖尿病肾病组(DKD组),每组5只。采用腹腔多次小剂量注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)构建小鼠糖尿病肾病动物模型。糖尿病肾病动物模型构建成功后,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清及肾组织中的糖基化终末产物羧甲基赖氨酸(Nε-(carboxymethyl)-lysine,CML)水平;检测小鼠血清随机血糖、白蛋白、肌酐、尿素氮水平。代谢笼收集小鼠24小时尿液,并检测小鼠尿蛋白;苏木精-伊红(Haematoxylin-eosin,HE)染色了解肾组织基质增生情况;天狼猩红染色了解肾组织胶原蛋白沉积情况;免疫组织化学法检测肾组织EMT相关指标(α-平滑肌动蛋白,α-SMA、E-钙粘蛋白,E-cadherin)表达情况;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测胶原I(Collagen I,Col-I)以及胶原IV(Collagen IV,Col-IV)的基因表达;蛋白质免疫印迹实验(Western blot)检测肾组织CD36表达水平;酰基-生物素置换实验(Acyl-Biotinyl Exchange,ABE)联合Western blot检测肾组织中CD36棕榈酰化水平。第二部分:将人肾近曲小管上皮细胞系(Human renal proximal tubular epithelial cells,HK-2)按不同干预措施分为3组,并给予CML及抑制蛋白棕榈酰化药物2-溴软脂酸乙烯(2-Bromopalmitate,2-BP)处理,分别为对照组(Ctrl组)、CML组(给予CML 100ug/ml)、CML+2-BP组(给予CML 100ug/ml+2-BP 150umol/L)。同时,在HK-2细胞中,转染慢病毒,使HK-2细胞高表达野生型CD36(WTOE)或棕榈酰化位点突变的CD36(AA-SS),构建稳定细胞系,并予以CML 100ug/ml处理。上述细胞经处理24小时后,Western blot检测细胞EMT相关指标(α-SMA、E-cadherin、波形蛋白,vimentin)以及CD36表达水平;ABE联合Western blot检测细胞中CD36棕榈酰化水平。第三部分:利用第一部分的动物模型,免疫组织化学法检测肾组织中具有棕榈酰基转移酶活性的蛋白DHHC4、DHHC6表达;利用第二部分的细胞模型,Western blot检测细胞DHHC4、DHHC6及SelN的表达,ABE联合Western blot检测DHHC4、DHHC6的酶活性,并采用免疫共沉淀法检测SelN与DHHC4、DHHC6的结合情况;对HK-2细胞进行SelN RNA干扰后给予CML 100ug/ml处理,ABE联合Western blot检测DHHC6的酶活性以及CD36棕榈酰化水平,Western blot检测细胞EMT相关指标(α-SMA、E-cadherin、vimentin)。结果:第一部分:成功构建糖尿病肾病动物模型。与CON组比较,第8周末DKD组小鼠随机血糖、血清尿素氮、血清及肾组织CML水平、24小时进食量、24小时尿量、24小时饮水量、24小时尿总蛋白(UTP)、肾组织胶原Col-I以及Col-IV的基因表达均明显升高(P<0.05),但血清白蛋白、体重均明显降低(P<0.05)。HE染色提示DKD组小鼠肾脏基质明显增生,天狼猩红染色提示DKD组小鼠肾脏纤维化程度明显高于CON组小鼠,免疫组化染色提示DKD小鼠肾脏表达的α-SMA高于CON组小鼠,但E-cadherin低于CON组小鼠。ABE联合Western blot提示DKD组小鼠肾组织CD36棕榈酰化水平较CON组小鼠明显升高(P<0.05)。上述结果提示糖尿病肾病小鼠肾组织启动纤维化进程,AGES以及CD36棕榈酰化有可能参于该病理进程。第二部分:Western blot提示在HK-2细胞中,CML明显提高α-SMA、vimentin表达水平(P<0.05),但降低E-cadherin表达(P<0.05),2-BP可以减弱CML上述的作用。ABE联合Western blot提示CML明显促进HK-2细胞中CD36棕榈酰化(P<0.05),该作用同样可被2-BP抑制。上述结果提示CML可以促进HK-2细胞EMT,外源性CD36棕榈酰化抑制剂可以改善上述作用。进一步在CML处理的HK-2细胞中,CD36棕榈酰化位点突变明显降低α-SMA、vimentin表达水平(P<0.05),但升高E-cadherin表达(P<0.05)。上述结果提示CML通过促进CD36棕榈酰化以诱导肾小管上皮细胞EMT。第三部分:ABE以及Western blot提示,CML可以提高HK-2细胞中DHHC6酰基转移酶活性及SelN表达水平(P<0.05)。生物信息学预测DHHC6可以和SelN结合,免疫共沉淀结果同样提示SelN可以和DHHC6形成复合物。在CML处理的HK-2细胞中,SelN siRNA降低DHHC6酰基转移酶活性、CD36棕榈酰化水平、α-SMA及vimentin表达水平(P<0.05),但升高了E-cadherin表达(P<0.05)。上述结果提示,在肾小管上皮细胞中,CML可以提高SelN表达水平,利于SelN与DHHC6形成复合物,促进两者共同发挥功能,提高DHHC6酰基转移酶活性以增加CD36棕榈酰化水平。结论:1.糖尿病肾病小鼠肾组织纤维化进程的启动与CD36棕榈酰化及AGES水平密切相关。2.在肾小管上皮细胞中,AGES通过提高CD36棕榈酰化水平促进肾小管上皮细胞EMT发生。3.在肾小管上皮细胞中,AGES通过促进SelN/DHHC6复合物的形成,增强DHHC6棕榈酰基转移酶活性,从而提高CD36棕榈酰化水平。