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众所周知,作为肝炎高发国,终末期肝病在我国有很高的发病率。肝移植作为治疗终末期肝病的唯一有效途径。移植肝的免疫排斥一直是不可回避和亟待解决的问题,应用免疫抑制剂虽能减少排斥反应的发生,但是它带来的并发症不可忽视。因此如何能够诱导移植物的自发免疫耐受,少用或者不用免疫抑制剂,成为移植免疫学研究的热点之一。自然发生调节性T细胞Tregs(naive Treg,nTreg),具有很强的免疫抑制作用,在诱导同种异体器官移植中免疫耐受的作用已得到证实。Tregs能够被TGF-β在体内及体外诱导。由T细胞诱导生成的调节性T细胞(iTreg)与nTreg具有相似的表型和功能特性,抵抗向Thl、Th17细胞的分化,抑制Th17细胞的分化和发育,可以弥补nTreg的不足,在移植免疫中更具应用价值和前景。诱导移植肝产生iTreg,主要需要两个条件:1.足够的T细胞,2.能够稳定表达TGF-β基因的合适载体。移植肝在术中受到缺血再灌注损伤,移植后也会因排斥或其它因素导致移植肝损伤,移植肝内部大量T细胞聚集,满足了 iTreg生成的第一个条件;间充质干细胞(MSCs)的两个特点使其成为携带TGF-β基因的绝佳载体:①MSCs易于被外源基因感染,是携带外源基因的良好载体。②MSCs具有向损伤组织趋化、迁移的特性,因此在肝移植引起的组织损伤微环境中,能够携带TGF-β1靶向性、高浓度地聚集于移植肝,从而满足了 iTreg生成的第二个条件。本研究中以MSCs介导TGF-[β 1诱导iTreg生成减轻移植肝急性排斥反应。第一部分:TGF/MSCs体系构建及体外实验研究TGF/MSCs对iTreg生成的影响目的:在体外分离培养大鼠骨髓MSCs,并进行鉴定,构建携带人转化生长因子-β1(TGF-[β 1)基因的慢病毒并感染MSCs,观察表达TGF-β 1 的MSCs(TGF/MSCs)的特性,体外检测TGF/MSCs的免疫抑制作用,并观察其诱导iTreg的生成效率。方法:利用贴壁加酶消化法培养大鼠MSCs,并进一步传代扩增,并利用显微镜观察其生长特性。同时对细胞绘制生长曲线。利用流式细胞仪检测细胞表面标志。构建hTGF-β 1慢病毒表达质粒,以GFP为标记。转染293T细胞,PCR测定其滴度。将慢病毒感染MSC细胞,检测其感染效率,利用ELISA法检测细胞培养上清hTGF-β 1、大鼠TGF-β 1(rTGF-β 1)分泌水平。同时再利用大鼠脾脏细胞构建体外混合淋巴细胞反应(MLR),检测TGF/MSCs细胞对T细胞增殖及IFN-y表达的抑制作用,同时用流式细胞仪测定iTreg的生成。结果:成功获得MSCs细胞,并能够再传代培养中得以进一步纯化。获取的MSCs,具有纯度高,生长良好,细胞增殖能力强的特点。5-6d左右传代,能在体外传代18代以上,增殖能力强大。检测了第3代的MSCs表面标志CD44为98.12%,呈阳性高表达。同时成功构建携带hTGF-β 1基因的慢病毒。MSCs感染携带hTGF-β 1基因的病毒上清后(细胞命名为TGF/MSC),RT-PCR可以检测出TGF-β 1 mRNA表达,ELISA和western Blot能够检测到TGF-β 1因子,相比于MSCs组TGF/MSCs组显著抑制IFN-γ的表达和淋巴细胞增殖。同时TGF/MSCs和MSCs在体外都能诱导iTreg的生成,而TGF/MSCs诱导生成更多,两者具有统计学差异。结论:贴壁加酶消化法分离培养MSCs简单易行,可以得到高纯度的MSCs,有稳定的生物学特征。通过慢病毒载体感染MSCs细胞,使其能够介导hTGF-β 1基因,表达hTGF-β 1基因的MSCs组相对于MSCs组有更强的免疫抑制作用,说明TGF-β 1和MSC两者在体外免疫抑制具有协同作用。第二部分:体内实验验证TGF/MSCs对iTreg生成的影响目的:观察表达hTGF-β 1基因的MSCs(TGF/MSCs)在大鼠体内对同种异体移植肝的急性排斥反应的抑制作用,探讨其诱导免疫耐受的机制。方法:建立稳定的DA-LEWIS大鼠同种异体肝移植急性排斥模型,供肝植入、肝脏复苏后立即经门静脉注入1mLPS,1*109 TU LV-TGF,5*106 MSCs或者TGF/MSCs。记录生存时间;另建立4组模型,分别于术后1,3,5,7天处死大鼠,3,5,7天观察肝功能,第7天行肝脏病理切片,绘制生存曲线,进行Banff评分,ELISA方法检测受体肝组织和血清中hTGF-β 1、IL-1(β、IL-6、IL-10、IFN-γ等细胞因子的水平。RT-PCR检测肝组织中hTGF-β 1、rTGF-β 1、IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-y mRNA表达,检测MSCs在肝脏内表达,ELISA法检测MSCs、上调因子CCR1、CXCR4、SDF-1的表达。流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+Tregs表达及在组织中的分布、Treg表面因子Helios表达,RT-PCR检测Il-17mRNA表达,流式细胞仪检测T细胞向Th-17细胞及iTreg转化。结果:RT-PCR证实TGF/MSCs组肝组织内有hTGF-β 1基因转录。生存曲线显示,TGF-[β/MSCs组明显好于其他各组。TGF/MSCs组、LV-TGF和MSCs组均能减轻移植肝的急性排斥反应,使受体状况得到改善。对比MSCs组和LV-TGF组,TGF/MSCs组使肝功能得到明显改善,病理学仅能看到轻度急性排斥反应。TGF/MSCs、LV-TGF及MSCs都能抑制T细胞增殖,而且TGF/MSCs组明显低于LV-TGF组及MSCs组。无论是在组织还是血清中,TGF/MSCs组、LV-TGF组及MSCs组促炎症因子IL-1,IL-6及IFN-y表达低于PS组,TGF/MSCs组明显低于TGF组及MSC组。而抑制炎症因子IL-10则正好相反。移植前我们用CM-DIL作为标记MSC,发现在术后第7天TGF/MSCs组CM-DIL标记细胞显著多于MSCs组,同样我们可以看到TGF/MSCs组MSC上调因子CCR1,SDF-1,CXCR4表达显著高于MSCs组,而PS组及LV-TGF组未见有上述表达,说明TGF-β 1促进MSCs向肝内聚集。由于携带有外源性hTGF-[β 1,第1天总TGF-β 1在TGF/MSCs组表达明显增高,同时我们观察到TGF-β 1在7天时TGF/MSCs组表达最低。与之对应的,术后第1天各组Tregs减少,以TGF/MSCs组减少最多,但是随着炎症反应的降低,各组的Treg逐步上升,而TGF/MSCs组的增加幅度最大,术后第5天开始与PS组有统计学意义,第7天该组CD4+Foxp3+细胞达到峰值。nTreg表达Hellos+,而iTregs则为Helios阴性,可以作为区别nTreg和iTreg的标记。我们进一步研究发现,在术后第7天Helios阴性之iTreg在各组明显增多,而以TGF/MSCs组最多,说明在经历了移植后第1天nTregs的大量丢失之后,又生成了新的iTreg;在TGF/MSCs组外周血、脾脏和肝脏组织内,又以肝脏内iTreg最多。结论:TGF/MSCs能有效减少肝移植术后免疫排斥反应并能提高生存时间。TGF/MSCs可通过抑制T细胞增殖及炎性因子的释放起作用。TGF/MSCs能有效诱导iTreg的产生及抑制Th17细胞的生成。TGF/MSCs组早期高水平的TGF-β1表达促进nTreg凋亡和iTreg生成,有效抑制免疫反应。TGF-β 1和MSCs在体内协同作用,效果好于单独使用。TGF/MSCs诱导的iTreg主要局限于移植肝内。