产紫杉醇内生真菌Fusarium mairei的菌种改良和发酵优化研究

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紫杉醇是一种二萜类衍生物,是当前公认的广谱、活性强的抗癌药物之一。1992年被美国食品与药物管理局(FDA)批准作为抗晚期癌症的新药上市。由于紫杉醇来源主要依靠日益贫乏的红豆杉树皮,致使目前国际市场价格居高不下,因此寻找其它的生产方法已成为国内外研究热点之一。近年来国内外很多研究人员也都相继报道其分离得到的产紫杉醇真菌。本论文以微生物发酵法生产紫杉醇的产量提高为目标,通过对已分离菌株美丽镰刀菌(Fusarium mairei) Y1117进行原生质体诱变并筛选得到一株产量较高的正突变株K178,然后对其发酵条件进行优化以进一步提高产量。其主要研究方法和结果如下:1.通过正交设计等实验方法,详细的研究了培养基成分、酶系组成、菌龄、渗透压缓冲剂、pH、酶解温度、时间和再生培养方式等多种因素对美丽镰刀菌原生质体制备和再生的影响。实验结果表明,将美丽镰刀菌通过先静止2d再以180r/min震摇2d后,在以0.6mol/L的KCl配制的pH为5的复合酶(3%溶壁酶、2.5%蜗牛酶、1%溶菌酶和0.5%纤维素酶)中,32℃恒温酶解4h,原生质体制备产量达3.2×107个/mL;纯化后的原生质体在25℃,以0.6mol/L的蔗糖配制的YCM再生培养基上单层培养,其再生率达8.9%。2.原生质体诱变方法和筛选方法的研究。在不同剂量条件下,分别采用紫外照射和DES作用,研究其对孢子和原生质体存活率的变化。确定较合适的诱变条件为:紫外照射(15W,30cm距离)30s,DES终浓度0.2%处理30min。在常规筛选的基础上同时进行了寻找合适药物筛子的研究。通过比较几种抗真菌药物的作用效果,选择以3μg/ml的制霉菌素作为药物筛,结果表明在其作用下正突变率较高为13%。同时,选择产量最高的一株K178作进一步的发酵研究。3.采用统计学方法对基本培养基组成进行一系列的优化研究,结果表明最优培养基组成为:葡萄糖80g/l,NH4NO3 7.84g/l,乙酸钠2.02 g/l,MgSO4 0.68g/l,KH2PO4 0.5 g/l,ZnSO4 1×10-3 g/l,Cu(NO3) 2 1×10-3 g/l,FeCl3 2×10-3 g/l,VB1 50×10-3 g/l,L-酪氨酸5×10-3 g/l。在该条件下发酵时紫杉醇产量可达225.2μg/l。在此基础上研究了几种前体的作用,结果表明适量的苯丙氨酸、苯甲酸钠和邻苯二酚添加均能提高紫杉醇产量。同时,基于Logistic方程建立了描述分批摇瓶发酵过程菌丝体生长的动力学数学模型。
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