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淅川乌骨鸡是稀有的地方鸡种,主要分布于我国河南省淅川县。具有典型的五黑特征（即喙、皮肤、骨骼、腿和肉等身体五个部位）,是乌骨鸡中的重要遗传资源。随着大家对“绿色食品”、“黑色食品”的关注,乌骨鸡成为绿色、健康食品的首选,使得肉用、蛋用、药用三位一体的淅川乌骨鸡市场需求也越来越高。消费者在购买乌鸡时,一般会通过肉眼观察乌鸡皮肤颜色作为购买依据。已知乌骨鸡皮肤肤色和黑色素含量与其产品价值和药用效果密切相关。乌骨鸡黑色素的形成是由酪氨酸酶催化产生的,在乌骨鸡中,酪氨酸代谢、基因与黑色素沉积之间可能存在一种协调调控机制,调控皮肤组织黑色素沉积。利用高通量测序技术和外源添加剂筛选调控皮肤黑色素沉积的关键基因,并通过体外和体内实验对筛选出的基因进行营养水平表达调控特性研究,探索营养素和色素沉积关键基因表达及黑色素沉积之间的关系。为完善家禽色素沉积形成的分子机制奠定基础,同时也为实际生产中研究营养性添加剂调控淅川乌骨鸡背肤颜色提供了更多的研究靶点和思路。本研究主要取得以下成果:1、基于全基因组重测序筛选淅川乌骨鸡肤色相关的候选基因对5只淅川乌骨鸡进行全基因组重测序,与数据库中下载的24个中国地方鸡重测序数据进行主成分分析和群体结构分析,结果表明与其他品种相比,浙川乌骨鸡是一个明显的分支;连锁不平衡分析结果表明,淅川乌骨鸡的选择强度高于其他鸡品种。我们着重关注了乌鸡受到的选择区域,通过注释分析有1,469个基因受到选择,pathway通路富集结果显示,这些受选择基因主要富集在神经活性配体-受体相互作用通路,cAMP信号通路,嘌呤代谢,甘油酯代谢,Wnt信号通路。20 号染色体10.74Mb-10.89Mb 区间的EDN3、SLMO2,ATP5e和LOC1017477896受到的选择强度最强,这一区域可能与淅川乌骨鸡的乌肤有关,可能是长期人工选择的产物。其中LOC101747896是一个新的长链的非编码RNA,且位于EDN3、SLMO2和ATP5e附近。EDN3和LOC101747896基因的系统进化树分析表明,乌鸡（丝羽乌骨鸡、东乡绿壳蛋鸡和淅川乌骨鸡）聚集在一个大分支上,进一步说明LOC101747896可能对黑色素沉积有影响。2、基于转录组测序筛选淅川乌骨鸡肤色相关的候选基因采用NR型色差仪检测淅川乌骨鸡黄肤和乌肤背肤颜色,结果表明乌肤的L值低于黄肤;黄肤和乌肤背肤组织HE染色表明,在乌肤的皮肤基底层和毛囊有大量的黑色素颗粒存在,黄肤中没有明显的黑色素颗粒。对1日龄黄肤和乌肤浙川乌骨鸡皮肤进行转录组测序,构建了淅川乌骨鸡不同背肤6个mRNA文库,筛选到17,148个mRNAs,16,608个mRNAs在黄肤和乌肤中都表达。345和195个mRNAs分别在黄肤和乌肤中特异表达。对黄肤和乌肤淅川乌骨鸡背肤组织中mRNAs进行差异表达分析,结果显示,黄肤与乌肤组织中的mRNA有171（147上调和24下调）表达水平差异显著（Fold-change≥2,且P-value≤0.05）。采用CNCl、CPAT、CPC、Pfam四种分析软件对淅川乌骨鸡皮肤进行lncRNAs筛选,共获得1,089个lncRNAs。其中有56个lncRNA差异表达（Fold-change≥2,且P-value≤ 0.05）。我们主要关注黑色素原生成通路,在基因表达分析中发现,6个基因（DCT、TYR、EDNRB2、MCIR、cAMP和KIT基因）乌肤组织中的表达量明显高于黄肤组织（P<0.05）。lncRNA-mRNA共表达网络互作分析,发现已知的位于20号染色体差异表达的黑色素基因,如EDN3,SLM02和ATP5e,分别位于TCONS00054154附近且表达模式呈正相关,TCONS00054154可能在渐川乌骨鸡乌肤黑色素沉积中起重要作用,为进一步从转录组水平研究lncRNA在鸡肤色色素沉积中的作用提供了理论依据。全基因组重测序乌鸡受选择的1,469个基因和转录组测序黄肤和乌肤差异表达的171个基因关联分析,有13个基因是两者共有的,其中有EDN3、SLMO2,ATP5e和LOC101747896基因,这些基因可能和色素沉积有关。3、非编码RNA 生物学功能研究利用 NCBI数据库对LOC101747896和TCONS54154 进行 BLAST比对,LOC101747896和 TCONS54154 都在 20 号染色体上,TCONS54154和LOC101747896的 transcript variant X5序列有100%相似性。生物信息学分析TCONS54154位于20染色体,RACE试验获得TCONS54154 序列全长3093 nt,包含6个外显子。编码能力预测分析表明为非编码RNA,符合lncRNA的特征。采用蛋白酶Ⅱ和胰酶消化法,体外分离培养淅川乌骨鸡黑色素细胞,对细胞进行形态学观察可知黑色素细胞呈三角形、梭状或者树突状;黑色素细胞生长曲线结果表明黑色素细胞前期生长缓慢,7 d后呈现指数增长,10 d后黑色素细胞的增殖能力有所下降;采用多巴染色、细胞免疫荧光染色、透射电镜观察等方法对分离的黑色素细胞进行鉴定,结果表明成功分离了淅川乌骨鸡黑色素细胞。亚细胞定位LMEP主要位于细胞质中。不同浓度酪氨酸处理黑色素细胞后,LMEP的表达量随着酪氨酸浓度的升高而显著增加（P<0.05）。LMEP在不同浓度酪氨酸处理的20周龄背肤组织中的表达量结果表明,相对于对照组,LMEP的表达量随着酪氨酸的浓度增加而增加,但是差异不显著（P>0.05）。过表达或者干扰LMEP后,检测细胞内酪氨酸酶的含量,相对于对照组,过表达LMEP后细胞内酪氨酸酶的含量显著升高（P<0.05）,干扰LMEP后细胞内的酪氨酸酶含量下降（P<0.05）。说明LMEP可能在色素沉积过程中起重要作用,为后续研究重点。4、外源添加酪氨酸对LMEP基因表达和黑色素合成的影响本试验通过细胞水平验证添加不同浓度（0、10-9、10-8、10-7、10-6 mol/L）的酪氨酸对黑色素细胞72 h形态和细胞内酪氨酸酶含量的影响,添加浓度为10-6 mol/L时细胞数量显著增多,黑色素细胞的胞质变大最为明显,且细胞内酪氨酸酶的含量最高。添加浓度为10-9 mol/L时能使黑色素细胞显著增殖（P<0.05）,随着酪氨酸添加量的增加呈下降趋势,但是高于对照组,说明酪氨酸可以促进黑色素细胞的增殖,但是有一定的剂量依赖效应。细胞水平检测LMEP和色素沉积相关基因在不同处理组的表达量,结果表明,相对于对照组,添加不同浓度的酪氨酸可以显著提高LMEP和色素相关基因的表达量（P<0.05）,进一步说明外源性营养添加剂酪氨酸可以影响色素相关基因的表达,酪氨酸和LMEP存在反馈调节作用。六组不同的日粮酪氨酸添加水平饲喂0～20周龄淅川乌骨鸡,分为对照组（0%）、处理组Ⅰ～V（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）。在酪氨酸添加量为0.8%时,20周龄淅川乌骨鸡血清中酪氨酸酶含量、背肤组织黑色素含量和皮肤颜色显著升高（P<0.05）。与对照组相比,在20周龄背肤组织中,LMEP和色素沉积相关基因的表达量有所升高,但是差异不显著（P>0.05）,说明色素沉积是多因素造成的,需要多层面进行后续研究。综上所述,整合全基因组重测序和转录组测序,筛选和色素沉积相关的基因,并在细胞水平和个体水平进行验证,LMEP可以增加黑色素细胞中酪氨酸酶的含量,不同添加量的酪氨酸可以使LEMP表达量的升高,说明LMEP和酪氨酸之间有反馈作用。该研究从外源性添加营养物质进而影响基因的表达,为实际生产中酪氨酸的最适添加剂量及酪氨酸在淅川乌骨鸡日粮中的合理利用提供科学依据,加深了对乌骨鸡黑色素沉积分子调控机制的理解,为淅川乌骨鸡黑色素沉积相关的营养调控和遗传育种提供基础。