马钱子功效为通络止痛,散结消肿等,具有抗炎镇痛、抗肿瘤、调节免疫、促进神经功能恢复、促进骨折愈合、修复软骨损伤、抗骨质增生、改善血液循环、改善酒精依赖、调节小肠运动等多方面的药理作用,但马钱子毒性大,导致其治疗窗窄,临床应用受限;白术功效为健脾益气,燥湿利水,止汗,安胎,止痹痛。历代医家认为白术配伍马钱子用于治疗痹证及风寒湿痛等疾病具有显著功效。现代药理学研究表明白术可以降低马钱子的毒性,增强其疗效。本课题组前期探究白术对马钱子的疗效影响的机制研究表明,白术对马钱子生物碱的肠吸收起抑制作用;白术配伍马钱子后降低了药物代谢酶对马钱子生物碱的清除能力;白术有效成分白术内酯Ⅱ通过抑制CYP450酶从而抑制马钱子碱和士的宁代谢;白术部分诱导CYP3A4酶活性;马钱子活性成分主要经CYP3A4酶代谢,却不会影响CYP3A4酶活性。白术配伍马钱子在吸收角度是抑制肠吸收,在代谢角度是抑制代谢,这两种结果必然导致血药浓度相反,为了探究是哪个环节对机体起主要药效作用,故进行白术配伍马钱子的大鼠药代动力学实验,从整体机体来反应两药配伍后的血液浓度变化。通常认为,白术内酯Ⅰ(AT-Ⅰ)和白术内酯Ⅱ为白术抗炎和抗癌的主要活性成分。为探究白术对马钱子药动学的影响机制,本课题组已经从代谢酶角度研究了白术和白术内脂Ⅱ对马钱子代谢酶的影响,因此本实验将进一步研究白术另一个有效成分白术内脂Ⅰ对马钱子代谢酶的相互作用。本实验有利于白术配伍马钱子临床安全用药的有效评估;探究白术内脂Ⅰ对CYP450代谢酶的相互作用,为白术联合其他药物进行临床应用提供基础依据。本文主要工作包括以下4个部分:1.白术对马钱子的药代动力学的影响采用LC-MS检测大鼠单次给药后不同时间点的血药浓度,并运用DAS 3.0软件计算药物的药动学参数,SPSS Statistics 21分析白术配伍马钱子前后马钱子生物碱主要药动学参数的差异,以此研究白术对马钱子中马钱子碱和士的宁大鼠药代动力学的影响。结果显示,马钱子碱在0.16-44.8 ng·mL-1,士的宁在0.34-96.0 ng·mL-1的范围内线性关系良好,方法学符合要求。药典剂量范围内,白术配伍马钱子后,马钱子生物碱在大鼠血浆中的主要药动学参数AUC0-t、AUC0-∞、Cmax均显著增加,表观分布容积Vz/F、清除率CLz/F减少。说明白术可以提高马钱子生物碱在体内的血药浓度,减少马钱子生物碱在体内的消除。结合本课题组前期研究推测代谢环节为血药浓度增加的主要环节。因此探究白术对马钱子增效减毒原理从代谢角度着手研究更具有说服力。血药浓度升高将导致疗效增加或者毒性增加,本实验所用剂量在药典范围内,远在中毒剂量之下,其最高血药浓度也在中毒血药浓度之下,表明药典剂量下,白术能增加马钱子的疗效。2.AT-Ⅰ在肝微粒体中的代谢动力学本章节采用肝微粒体体外孵育法,优化AT-Ⅰ在人肝和鼠肝肝微粒体的孵育条件,采用底物消除法计算AT-Ⅰ在人肝和鼠肝肝微粒体中的代谢动力学。结果显示AT-Ⅰ在人肝和鼠肝肝微粒体中代谢参数Vmax(最大反应速率),S50(常数),CLint(清除率),n(底物结合的 Hill 系数)分别为 34.93±2.009 和 1672±433.6 pmol/min/mg protein,0.2898±0.0192 和 0.6355±0.1886μM,0.12±0.0007 和 2.63±0.000 3 mL/min/mg protein;2.451±0.2079和1.618±0.161。代谢动力学参数S50为研究AT-Ⅰ的代谢途径中所用的最佳代谢剂量。3.AT-Ⅰ在肝微粒体中的代谢表型研究本章采用化学抑制剂法和重组酶对AT-Ⅰ的代谢亚型酶表型进行研究,通过不同浓度的特异性化学抑制剂作用在CYP1A2、CYP2C19、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4这5种酶后AT-Ⅰ的代谢情况,以及分别在5种重组酶中AT-Ⅰ的代谢情况来鉴别参与AT-Ⅰ代谢的CYP450酶表型。AT-Ⅰ的代谢受酮康唑抑制最明显,其次是诺卡酮,剩余3种抑制剂仅少部分抑制,或几乎无抑制。表明AT-Ⅰ主要经CYP3A4、CYP2C19酶代谢,而仅少部分经过CYP1A2和CYP2C9酶代谢。对比抑制率发现在大鼠体内,CYP3A4酶对AT-Ⅰ的代谢贡献要大于CYP2C19酶;在人体内,CYP2C19酶对AT-Ⅰ的代谢贡献要大于CYP3A4酶。马钱子活性成分主要经CYP3A4酶代谢,说明白术可能通过竞争CYP3A4酶来降低马钱子活性成分的代谢量,推测此为白术增加马钱子血药浓度的机制之一。4.AT-Ⅰ对CYP450酶的作用研究考察AT-Ⅰ对临床常见的药物代谢CYP450酶亚型活性的影响研究,以不同浓度AT-Ⅰ与探针药物共孵育,检测探针药物的代谢情况。采用Graphpad Prism 6.0软件计算AT-Ⅰ对CYP450酶亚型的IC50值,且进一步探讨AT-Ⅰ对肝微粒体CYP450酶的抑制类型。结果表明,随着AT-Ⅰ浓度的升高,各CYP酶活性逐渐降低,人肝微粒体中,AT-Ⅰ对CYP2C19为中等强度抑制作用,IC50值为49.25μM,对CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4为弱抑制作用,IC50值为106.2、57.02、58.53、66.27μM;鼠肝微粒体中,AT-Ⅰ对CYP2C19、CYP 2C9、CYP2D6 为中等强度抑制作用,IC50 值为 47.08、22.93、30.37μM,对 CYP1A2为弱抑制作用,IC50值为67.1μM。综合人肝和鼠肝微粒体发现AT-Ⅰ对CYP2C19为中等强度抑制作用;但是在人肝微粒体中AT-Ⅰ对CYP3A4是弱抑制作用,在鼠肝微粒体中AT-Ⅰ对CYP3A4是诱导作用。人肝微粒体中AT-Ⅰ对CYP1A2和CYP2D6为非竞争性抑制,其Ki值分别为84.67、84.52μM,对CYP2C19、CYP2C9和CYP3A4为混合型抑制,其Ki值分别为74.64、38.70、>200μM。鼠肝微粒体中AT-Ⅰ对CYP2C9为竞争性抑制,Ki值为94.23μM,对CYP1A2为非竞争性抑制,Ki值为31.37μM,对CYP2C19和CYP2D6为混合模型抑制,Ki值为83.04、>200μM。AT-Ⅰ对CYP450酶的影响研究结果可以证实,AT-Ⅰ不易于与其他药物发生相互作用。马钱子经过CYP3A4酶代谢,人肝中发现AT-Ⅰ对CYP3A4酶活性产生弱抑制可能导致马钱子的代谢减少。而在鼠肝中AT-Ⅰ会诱导CYP3A4酶活性,在白术与马钱子代谢配伍应用时,白术对酶的结合能力可能大于马钱子,使CYP3A4酶对白术的代谢增多而对马钱子的代谢相对减少,推测此为白术增加马钱子有效成分血药浓度的机制之二。