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背景黑色素瘤是一种源于神经黑色素细胞、具有高度转移能力的恶性肿瘤,可发生于患者身体的各个部位。尽管目前存在多种治疗肿瘤的方法手段,但转移性黑色素瘤患者的预后效果并不乐观。因此,进一步深入研究恶性黑色素瘤的转移发展机制,寻找预防以及治疗黑色素瘤转移的有效靶点成为目前亟待解决的问题。神经细胞黏附分子(Neural cell adhesion molecule,NCAM),属于免疫球蛋白超家族的一员,在神经系统高度表达,主要参与调节神经细胞的黏附、迁移、分化及突触形成等。近期的研究发现,NCAM还参与肿瘤细胞的侵袭、发展及肿瘤转移。我们前期针对骨髓间充质干细胞的研究表明,敲除NCAM基因能抑制骨髓间充质干细胞定向伪足的形成,进而影响细胞的迁移能力。然而,关于NCAM在人恶性黑色素瘤中的作用及机制尚缺少相关数据。本研究的目的在于评价NCAM对人恶性黑色素瘤A375和M102细胞迁移的影响以及可能参与调控的分子机制。目的1.明确NCAM对人恶性黑色素瘤A375和M102细胞迁移的影响;2.探索NCAM影响人恶性黑色素瘤细胞迁移的分子机制。方法1.筛选NCAM基因沉默的人恶性黑色素瘤稳转细胞系用携带shNCAM质粒的慢病毒感染人恶性黑色素瘤A375和M102细胞,96 h后,用含有最佳筛选浓度的嘌呤霉素的培养基继续培养细胞,筛选得到两种NCAM基因沉默的人恶性黑色素瘤稳转细胞系。2.检测NCAM对人恶性黑色素瘤细胞迁移能力的影响通过划痕愈合实验和Transwell迁移实验分析NCAM基因沉默对人恶性黑色素瘤细胞迁移的影响。3.检测NCAM对人恶性黑色素瘤细胞肌动蛋白骨架重排的影响通过免疫荧光和Western blot实验分析NCAM基因沉默对人恶性黑色素瘤细胞肌动蛋白骨架重排及肌动蛋白结合蛋白cofilin活性的影响。4.分析NCAM影响人恶性黑色素瘤细胞肌动蛋白骨架重排的相关作用机制首先,通过查阅文献寻找既位于NCAM的下游又与肌动蛋白骨架重排相关的信号分子,最终目标锁定Src/Akt信号途径。然后通过Western blot实验检测NCAM基因沉默对Src及Akt磷酸化水平的影响;进一步地,向正常的黑色素瘤细胞中分别加入Src抑制剂PP2和Akt抑制剂LY294002,检测Src/Akt信号通路被抑制后对cofilin活性的影响。结果1.用携带shNCAM质粒的慢病毒分别感染人恶性黑色素瘤A375和M102细胞,获得两种NCAM基因沉默的稳转细胞系,所获得的稳转细胞系用于后续的实验;2.NCAM基因沉默抑制人恶性黑色素瘤细胞A375和M102的迁移;3.NCAM基因沉默抑制人恶性黑色素瘤细胞A375和M102中cofilin的磷酸化,进而影响肌动蛋白骨架的重排;4.NCAM基因沉默抑制人恶性黑色素瘤细胞A375和M102中Src和Akt的磷酸化水平;当在A375和M102细胞中分别加入Akt和Src抑制剂后,cofilin的磷酸化水平均明显降低。结论1.NCAM调控人恶性黑色素瘤细胞A375和M102的迁移;2.NCAM可能通过Src/Akt信号通路影响cofilin的磷酸化,进而调控黑色素瘤细胞肌动蛋白骨架的重排。