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目的:1.在体内实验中,明确左归丸对GIOP的治疗作用,并分析let-7f及自噬相关因子在左归丸治疗GIOP过程中的变化情况;2.在体外实验中,探讨左归丸调控let-7f与自噬crosstalk促进BMSCs成骨分化的作用及机制。方法:1.动物实验研究(1)左归丸对GIOP大鼠的治疗作用60只6月龄SD大鼠随机分为三组:空白对照组(CON)、模型组(GIOP)、左归丸治疗组(ZGW),每组20只。应用地塞米松注射液成功构建GIOP模型后(3个月),给予相应药物干预,分别在药物干预后1个月(M1),2个月(M2)和3个月(M3)进行取材,检测指标:①腹主动脉取血检测血清ALP活性;②分离大鼠L1-3椎体,检测骨密度;③在②结束后,分离出L2椎体,行μ CT扫描、三维重建;④在③结束后,去除L2椎体外组织(如附件、软组织和终板软骨),将椎体两端磨平为“上下端平行、约5mm高”的圆柱体,行腰椎压缩试验;⑤分离出L4椎体,行HE染色观察腰椎骨组织形态学变化。(2)左归丸治疗GIOP大鼠后腰椎成骨细胞自噬体数量的变化分离出(1)中L5椎体,透射电镜下观察成骨细胞超微结构,检测自噬体数量变化;(3)左归丸治疗GIOP大鼠后腰椎let-7f和自噬相关因子的变化①取(1)中L6椎体,去除椎体外组织,于液氮保存;②RT-qPCR检测①骨组织中let-7f、ULK2、Beclin-1、LC3、ATG5、ATG12、Runx2、Opn、Alp、Ocn基因的表达。2.细胞实验研究(1)let-7f与ULK2的靶向调控关系①293T细胞培养,包装慢病毒载体;②生物信息学预测let-7f与ULK2的靶向调控关系,包括TargetScan 7.2(http://targetscan.org),miRBase,RNA22,DIANA-mT,miRDB,PICTAR5,PITA及miRanda;③构建报告基因载体后,细胞铺板(空载组,let-7f模拟物+野生型,let-7f模拟物阴性对照+野生型,let-7f抑制剂+野生型,let-7f抑制剂阴性对照+野生型,let-7f模拟物+突变型,let-7f模拟物阴性对照+突变型,let-7f抑制剂+突变型,let-7f抑制剂阴性对照+突变型),转染,荧光素酶活性检测let-7f与ULK2的靶向结合关系。(2)左归丸调控let-7f与自噬crosstalk对BMSCs成骨分化的作用①制备左归丸水提液备用;②提取大鼠BMSCs培养、传代、冻存备用;③CCK8检测不同浓度左归丸水提液干预后,细胞在第1、3、5、7、14天的增殖情况;选取左归丸水提液最佳浓度,用于后续实验;④构建let-7f过表达/沉默载体,转染BMSCs,左归丸水提液最佳浓度干预并进行成骨诱导,分组:a.空载体miRNA组;b.let-7f过表达组;c.let-7f过表达+ZGW组;d.空载体plux组;e.let-7f沉默组;f.let-7f沉默+ZGW组;检测ALP染色、ARS染色,RT-qPCR检测let-7f表达,Western-blot检测自噬相关因子的表达情况(ULK2、Beclin-1、ATG5、ATG12、LC3B);⑤let-7f过表达载体转染BMSCs后,应用自噬激活剂(雷帕霉素)及左归丸水提液最佳浓度干预,分组:a.空载体miRNA组;b.雷帕霉素组;d.let-7f过表达+雷帕霉素组;c.let-7f过表达+雷帕霉素+ZGW组;检测ALP染色、ARS染色,RT-qPCR检测验证let-7f表达,Western-blot检测自噬相关因子ULK2及Beclin-1的表达情况。结果:1.动物实验研究(1)左归丸有效改善GIOP大鼠骨损害①左归丸提高GIOP大鼠腰椎骨密度与CON组比较,GIOP组BMD、BMC在M1、M2和M3时均明显降低(P<0.05),且ZGW组BMD、BMC在M1、M2和M3时均明显高于GIOP组(P<0.05)。②左归丸改善GIOP大鼠腰椎骨微细结构破坏在M1、M2和M3时,与CON组比较,GIOP组BV/TV、Tb.N、Tb.Th、vBMD均明显降低(P<0.05),SMI 及 Tb.Sp 明显增加(P<0.05);与 GIOP 组比较,ZGW 组 BV/TV、Tb.N及vBMD在M1、M2和M3时均显著高于GIOP组(P<0.05),SMI在M1、M2和M3时均显著低于GIOP组(P<0.05),Tb.Th在M3时显著高于GIOP组(P<0.05),Tb.Sp在M3时显著低于GIOP组(P<0.05)。三维重建图亦显示GIOP组骨微细结构较CON组严重破坏,而ZGW组可显著改善GIOP骨微细结构破坏。③左归丸提高GIOP大鼠腰椎骨强度在M1、M2和M3时,与CON组比较,GIOP组压缩强度显著降低(P<0.05),能量吸收值在M2及M3时显著降低(P<0.05)。与GIOP组对比,ZGW组在不同时间点的压缩强度、在M3时的压缩刚度及能量吸收值均显著提高(P<0.05)。④左归丸改善GIOP大鼠腰椎骨组织形态学损害在不同时间点,GIOP组对骨小梁有不同程度的损害,包括骨小梁数量减少、小梁断裂,小梁间隙增宽;骨小梁表面成、破骨细胞数量减少,髓腔内脂肪泡显著增多等。而ZGW组在不同时间点均可有效改善以上骨小梁损害。⑤左归丸提高GIOP大鼠血清ALP活性在M2、M3时,与CON组比较,GIOP组ALP活性明显降低(P<0.05),而ZGW组具有显著的逆转作用(P<0.05)。(2)左归丸提高GIOP大鼠腰椎成骨细胞自噬体数量与CON组比较,在不同时间点(4周、8周、12周)GIOP组自噬体数量明显增加,提示GC激活了 OB的自噬过程;而ZGW组在不同时间点的自噬体数量均得到不同程度的恢复,说明在不同时间点,ZGW可有效抑制GC诱导的自噬过度。(3)左归丸促进GIOP大鼠腰椎let-7f及成骨相关因子的表达,抑制自噬相关因子的表达在 M1 时,GC 显著提高ULK2、Beclin-1、LC3B及 ATG5 mRNA 水平(P<0.01,P<0.001),在M2时,GC显著抑制let-7f表达,显著促进Beclin-1、ATG5及ATG12基因表达(P<0.01,P<0.001),在M3时,GC显著抑制let-7f表达,显著提高ULK2、Becli 1、LC3B、ATG-5及ATG12 mRNA水平(P<0.05,P<0.001),提示GC可抑制腰椎let-7f表达,同时显著提高自噬水平。ZGW治疗实验中,在M1时,ZGW显著下调ULK2及ATG5 mRNA水平(P<0.05,P<O.001),在M2时,ZGW显著促进let-7f表达,显著抑制ULK2、Beclin-1、ATG5及ATG12基因表达(P<0.05,P<0.01,P<0.001),在M3时,ZGW显著促进let-7f表达,显著降低ULK2、Beclin-1、LC3B及ATG5 mRNA水平(P<0.05,P<0.01,P<0.001),提示ZGW可逆转GC诱导的let-7f表达抑制及自噬过度。在M1时,GC显著下调Alp mRNA水平(P<0.01),在M2时,GC显著降低Opn、Alp及Ocn mRNA 水平(P<0.05,P<0.01),在 M3 时,GC 显著下调Runx2、Opn、Alp Ocn mRNA水平(P<0.01,P<0.001),提示GC显著抑制成骨。ZGW治疗实验中,在M2时,ZGW显著促进Alp及Ocn基因表达(P<0.05,P<0.01),在M3时,ZGW显著促进Runx2、Opn、Alp及Ocn基因表达(P<0.05,P<0.01),提示ZGW可逆转GC诱导的成骨抑制。2.细胞实验研究(1)let-7f 靶向调控 ULK2①生物信息学预测let-7f与ULK2具有靶向结合位点;②荧光素酶报告基因检测显示,与空载组对比,let-7f模拟物+野生型显著降低ULK2的表达(P<0.01),且与let-7f模拟物+野生型对比,let-7f抑制剂+野生型显著提高ULK2的表达(P<0.01),表明let-7f与ULK2具有靶向调控作用;而在转染的突变型载体中,ULK2表达无统计学差异。(2)左归丸上调let-7f表达,抑制自噬,促进BMSCs成骨分化①细胞增殖实验中,ZGW干预7天后细胞增殖呈剂量性提高,之后逐渐下降(10ug/ml浓度最佳);②成骨分化实验中,let-7f过表达组及let-7f过表达+ZGW组ALP阳性染色及钙化结节明显增强;let-7f沉默显著抑制ALP阳性染色和钙化结节形成,而ZGW显著逆转let-7f沉默效应。雷帕霉素组可显著抑制空载体miRNA组及let-7f过表达组的ALP阳性染色及钙化结节形成,而ZGW可逆转雷帕霉素对ALP阳性染色及钙化结节形成的抑制作用。③let-7f过表达及沉默后let-7f表达显著提高(P<0.01)或降低(P<0.001),验证了过表达/沉默载体转染成功;雷帕霉素显著抑制let-7f表达(P<0.01),而ZGW具有逆转作用(P<0.01)。④let-7f过表达可显著抑制自噬相关蛋白ULK2、ATG5、ATG12、Beclin1、LC3B的表达,ZGW干预也抑制自噬相关蛋白的表达,尽管抑制作用较let-7f过表达弱,而let-7f过表达联合ZGW亦显著抑制自噬相关蛋白的表达,且抑制效果比单独let-7f过表达更强。同样,在let-7f沉默空载体中,ZGW干预可抑制自噬相关蛋白的表达;let-7f沉默可促进自噬相关蛋白的表达,且let-7f沉默联合ZGW亦显著抑制自噬相关蛋白的表达。雷帕霉素可显著促进自噬相关因子ULK2及Beclin-1的表达,而ZGW起到明显的逆转作用。结论:1.动物实验研究:(1)左归丸可有效改善GIOP骨损害(提高骨量、改善骨微细结构、提高骨强度、改善骨组织形态损害、提高血清ALP活性、促进成骨标志基因Runx2、Opn、Alp、Ocn表达);(2)左归丸可逆转“GC抑制大鼠腰椎let-7f表达及GC诱导成骨细胞自噬过度”(大鼠腰椎let-7f表达显著回升、成骨细胞自噬体数量显著降低、自噬相关因子ULK2、Beclin-1、LC3、ATG5、ATG12显著下调)。2.细胞实验研究:(1)生物信息学预测及双荧光素酶报告基因检测验证let-7f靶向结合ULK2,负向调控ULK2表达;(2)通过let-7f过表达/沉默以及应用自噬激活剂等方法,本研究表明ZGW可能通过调控let-7f与自噬crosstalk,从而促进BMSCs成骨分化。