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骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)又称退行性骨关节病,是常见的老年性疾病之一。随着我国人口老龄化的加剧,OA患病率呈逐渐上升的趋势,OA已成为影响我国中老年人健康与生活质量的重大问题,给患者、家庭和社会造成巨大的经济负担。目前临床上针对OA的治疗主要有药物对症治疗和关节置换手术两种方法,均以缓解临床症状为主,不能改变疾病的进程,迄今尚无有效的病因治疗方法。凋亡是机体通过基因调控方式主动清除不需要的或异常的特定细胞的一种生理调控过程。软骨细胞作为正常关节软骨中的唯一细胞成分,软骨细胞过度凋亡导致的软骨细胞丰度降低和软骨细胞外基质降解被认为是OA的主要病因。近年来,自噬作为机体维持细胞正常功能和稳态的一种机制,被发现与凋亡存在紧密的联系。一些研究表明,增强自噬可以起到抗软骨细胞凋亡的作用,能延缓OA的进展。为此,药物性激活自噬在未来可能成为一种治疗OA的有效方法。炎症反应对OA的发生发展有着重要作用。促炎症细胞因子是导致软骨细胞凋亡的关键介质之一,其中白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNFα)被普遍认为是引起关节软骨基质降解的主要促炎症细胞因子。此外,近年来发现其他促炎症细胞因子如白细胞介素18(Interleukin-18,IL-18)也在OA发生发展过程中起着关键作用。先前研究表明,IL-18在OA患者滑膜液中的浓度明显升高,能诱导滑膜细胞和软骨细胞的炎症反应。近来还发现IL-18能诱导人软骨细胞的凋亡。然而,IL-18对软骨细胞自噬调控的影响尚不明确。因此,本次研究旨在探讨IL-18对软骨细胞自噬调控的影响及可能涉及的作用机制,并探索潜在的病因治疗方案。本次研究主要分成四部分:一、首先研究了IL-18对大鼠软骨细胞凋亡的影响。我们的研究发现IL-18能诱导体外培养的软骨细胞退变和软骨细胞凋亡,并在体内大鼠膝关节腔注射模型中观察到关节软骨退变的表现。二、使用IL-18处理体外培养的大鼠软骨细胞,探索IL-18对大鼠软骨细胞自噬的影响。结果发现高浓度IL-18能介导软骨细胞自噬不足。三、在体外培养的软骨细胞中,研究IL-18引起软骨细胞自噬不足的具体分子机制及其与软骨细胞退变的关系。结果发现IL-18引起软骨细胞自噬不足主要是通过PI3K-Akt-m TOR信号通路实现的,且与软骨细胞退变密切相关。四、在体外培养的大鼠软骨细胞以及体内大鼠膝关节腔注射模型中,观察常见自噬激动剂雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)对IL-18介导的自噬不足和凋亡的影响。结果显示雷帕霉素能改善IL-18介导的自噬不足,并起到拮抗IL-18介导的促软骨细胞凋亡作用。我们的研究结果综合表明,IL-18介导的软骨细胞自噬不足能促进软骨细胞凋亡,在OA的发生发展中起重要作用;而且雷帕霉素能通过激活自噬起软骨保护作用,为OA提供了一种潜在的病因治疗方法。第一章IL-18对软骨细胞凋亡的影响目的:探究IL-18对大鼠软骨细胞凋亡的影响情况。研究方法:取4周龄(Sprague-Dawley,SD)大鼠关节软骨细胞进行体外分离培养,传代次数控制在4代以内。应用不同浓度的IL-18(0-100ng/m L)处理软骨细胞24小时后,用实时定量聚合酶链式反应(Real-Time Polymerase chain reaction,RT-PCR)法和Western免疫印迹(Western-blot)法分别检测细胞内软骨细胞表型基因Col2,Sox9和Aggrecan在m RNA和蛋白水平的表达变化,用Western-blot法检测细胞内凋亡相关因子包括凋亡抑制因子B型淋巴瘤细胞2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2),凋亡促进因子Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)和Caspase3/9在蛋白水平的表达变化。取20只6周龄雄性SD大鼠(150-200g),随机分为2组,每组10只,分别为正常对照组和100ng/m L IL-18组,对照组大鼠注射50μL生理盐水,实验组大鼠注射等剂量含100ng/m L IL-18的生理盐水。每周注射2次,8周后处死动物,取膝关节标本进行番红-固绿染色及免疫组化检测,观察软骨退变情况以及聚蛋白聚糖(Aggrecan)、基质金属蛋白酶13(Matrix Metallopeptidase 13,MMP13)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)在组织中的表达情况。结果:在体外培养的大鼠软骨细胞中,IL-18能显著降低软骨细胞表型基因Col2,Sox9和Aggrecan在m RNA和蛋白质水平的表达,同时也显著抑制Bcl-2的表达,促进Bax和Caspase3/9的表达。动物体内实验结果显示,注射IL-18的大鼠膝关节退变程度较正常对照组轻,Aggrecan和MMP13表达减少,Caspase3表达增高。结论:IL-18对大鼠软骨细胞凋亡具有促进作用,且能引起关节软骨退变。第二章IL-18对软骨细胞自噬的影响目的:探究IL-18对大鼠软骨细胞自噬的影响情况。研究方法:取4周龄SD大鼠关节软骨细胞进行体外分离培养,传代次数控制在4代以内。应用浓度为100ng/m L的IL-18处理软骨细胞不同时间(0-24h)后,通过Westernblot法检测Atg5,Atg7,Beclin1,LC3B和P62等自噬标志物在蛋白质水平的表达情况,同时通过LC3B免疫荧光检测自噬小体随IL-18处理时间的变化。结果:Western-blot结果显示,浓度为100ng/m L的IL-18处理体外培养大鼠软骨细胞2小时后,软骨细胞内自噬标志物Atg5,Atg7和Beclin1蛋白水平表达显著升高,LC3B II/LC3B I比例显著上升。而在处理6,12和24小时的软骨细胞中,软骨细胞内自噬标志物Atg5,Atg7和Beclin1蛋白水平表达明显逐步降低,LC3B II/LC3B I比例逐步下降,处理24小时后基本降至基线水平。而自噬底物P62蛋白水平则随IL-18处理时间的增加而在软骨细胞内逐渐积累。免疫荧光结果显示,浓度为100ng/m L的IL-18处理体外培养大鼠软骨细胞6小时后,LC3B荧光强度显著增加,而24小时后荧光强度又明显降低。结论:大鼠软骨细胞在受到IL-18刺激的初始阶段能引起较强的自噬反应,而随着IL-18作用时间的延长,大鼠软骨细胞内自噬小体形成减少,自噬能力减弱。IL-18的慢性刺激能介导大鼠软骨细胞的自噬不足。第三章IL-18引起软骨细胞自噬不足的具体分子机制研究及其与软骨细胞退变的相关性研究目的:探究IL-18引起大鼠软骨细胞自噬不足的具体分子机制,并探索其与IL-18介导的大鼠软骨细胞退变之间的关系。研究方法:取4周龄SD大鼠关节软骨细胞进行体外分离培养,传代次数控制在4代以内。应用不同浓度的IL-18(0-100ng/m L)处理软骨细胞24小时后,通过Westernblot法检测PI3K-Akt-m TOR通路关键蛋白PI3K,Akt,m TOR的磷酸化程度。此外,我们设计了一系列通路抑制和激活实验,用PI3K激动剂740Y-P,Akt激动剂SC79,m TOR激动剂3BDO和PI3K抑制剂LY294002分别预处理细胞1小时后,再应用浓度为100ng/m L的IL-18处理24小时,通过Western-blot法检测软骨特异性基因Col2,Sox9和Aggrecan在蛋白质水平的表达情况。结果:在体外培养的大鼠软骨细胞中,IL-18能增加PI3K,Akt,m TOR的磷酸化水平,在浓度为10ng/m L和100ng/m L时更为明显。PI3K-Akt-m TOR通路抑制和激活实验结果显示,激活PI3K,Akt和m TOR均可显著降低软骨细胞表型基因Col2,Sox9和Aggrecan在蛋白质水平的表达,而抑制PI3K可显著升高Col2,Sox9和Aggrecan基因在在蛋白质水平的表达。结论:IL-18引起大鼠软骨细胞自噬不足主要是通过PI3K-Akt-m TOR信号通路实现的,且与大鼠软骨细胞退变密切相关。第四章雷帕霉素对IL-18介导的软骨细胞自噬不足和凋亡的作用研究目的:探究常见自噬激动剂雷帕霉素对IL-18介导的大鼠软骨细胞自噬不足和凋亡的影响。研究方法:取4周龄SD大鼠关节软骨细胞进行体外分离培养,传代次数控制在4代以内。取P3代软骨细胞分为4组:正常对照组不做处理,IL-18组应用浓度为100ng/m L的IL-18处理24小时,Rapa组应用浓度为10n M的雷帕霉素处理24小时,IL-18+Rapa组应用浓度为10n M的雷帕霉素预处理1小时后加入浓度为100ng/m L的IL-18共处理24小时。通过Western-blot法检测Atg5,Atg7,Beclin1,LC3B和P62等自噬标志物以及Bcl-2,Bax和Caspase3/9等凋亡相关因子在蛋白质水平的表达情况。取40只6周龄雄性SD大鼠(150-200g),随机分为4组,每组10只:正常对照组大鼠注射50μL生理盐水,IL-18组大鼠注射等剂量含100ng/m L IL-18的生理盐水,Rapa组大鼠注射等剂量含10n M雷帕霉素的生理盐水,IL-18+Rapa组注射等剂量含100ng/m L IL-18和10n M雷帕霉素的生理盐水。每周注射2次,8周后处死动物,取膝关节标本进行番红-固绿染色及免疫组化检测,观察软骨退变情况以及Atg5和Caspase3的表达。结果:在体外培养的大鼠软骨细胞中,雷帕霉素显著拮抗IL-18诱导24小时后大鼠软骨细胞中Atg7基因在蛋白质水平的表达下调、LC3B II/LC3B I比例的下降以及自噬底物P62的增加,同时雷帕霉素也显著拮抗IL-18诱导24小时后大鼠软骨细胞中Bcl-2基因的表达下调以及Bax和Caspase3/9基因的表达上调。动物体内实验结果显示,IL-18+Rapa组相较于IL-18组,大鼠膝关节退变程度较轻,Atg5表达增加,Caspase3表达减少。结论:雷帕霉素能改善IL-18介导的大鼠软骨细胞自噬不足,并起着抗软骨细胞凋亡和软骨保护作用。