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本研究根据课题组前期对水牛GV/MII期卵母细胞对应卵丘细胞的micro RNA(miRNA)高通量测序结果,在MII期卵丘细胞显著上调的24条差异表达miRNAs中选择了一条可能与颗粒细胞(Granulosa Cells,GCs)凋亡相关的miR-23a进行研究。初步探讨了miR-23a及其靶基因对水牛GCs体外培养过程中细胞凋亡的调控作用及其分子机制,为提高水牛卵母细胞体外成熟效率提供理论基础。研究取得如下主要结果:1.miR-23a预测靶基因CELF1的筛选及靶向关系验证。本研究对miR-23a预测的1237个靶基因进行GO富集和KEGG分析,发现靶基因主要参与核糖体等信号通路,这些通路主要集中在对细胞的增殖、凋亡、物质代谢等调控,并筛选出关键靶基因CELF1。RT-q PCR分析miR-23a在水牛不同组织的表达情况,结果发现miR-23a在卵巢中高表达,在睾丸和附睾中微表达。为进一步验证miR-23a与CELF1的靶向关系,RT-q PCR检测结果发现水牛GCs中添加miR-23a mimic显著降低GCs中CELF1的m RNA表达(P<0.05);进而双荧光素酶试验亦证明miR-23a与CELF1存在靶向关系。2.探讨了miR-23a靶向CELF1对水牛颗粒细胞凋亡的影响。为了研究miR-23a对水牛GCs凋亡和增殖的影响,在体外培养的水牛GCs中添加miR-23a mimic/inhibitor,采用流式细胞仪技术检测细胞凋亡情况,结果发现miR-23a mimic能显著促进水牛GCs的凋亡(P<0.05);Ed U染色结果显示,miR-23a mimic抑制细胞的增殖(P<0.05),而miR-23a inhibitor则相反。其次,构建了pc-DNA3.1-CELF1过表达载体,瞬时转染到体外培养的水牛GCs中,结果发现CELF1可以显著促进水牛GCs增殖,抑制细胞凋亡(P<0.05),过表达CELF1同miR-23a inhibitor结果一致。而且,通过RT-q PCR、Western blot技术检测细胞凋亡相关基因和蛋白的相对表达量,发现miR-23a mimic促进水牛GCs中凋亡相关基因BAX、caspase3和P53的m RNA和蛋白表达,抑制抗凋亡基因Bcl2 m RNA和蛋白表达;而CELF1同miR-23a mimic结果相反。进而将miR-23a和CELF1共同转入水牛GCs时,结果发现CELF1可逆转miR-23a对水牛GCs凋亡的作用。ELISA试验检测miR-23a和CELF1对水牛GCs类固醇激素分泌的影响,结果显示,miR-23a mimic使雌二醇(E2)分泌显著下降(P<0.05),孕酮(P4)的分泌显著升高(P<0.05);过表达CELF1的结果和miR-23a mimic相反;而miR-23a和CELF1共转后CELF1可逆转miR-23a对GCs分泌E2的抑制作用。此外,采用RT-q PCR检测PI3K/AKT通路相关基因表达的变化,以进一步验证miR-23a通过靶向CELF1调控细胞凋亡的分子机理,结果显示,miR-23a下调PI3K(P<0.05)和AKT(P>0.05)的基因表达,上调通路基因PTEN的表达(P<0.05);miR-23a和CELF1共转后可以解除miR-23a对PI3K和AKT基因的抑制表达作用(P<0.05),抑制miR-23a对PTEN基因的促进表达作用(P<0.05)。以上结果表明:(1)miR-23a在水牛卵巢中高表达,miR-23a与CELF1存在靶向关系;(2)miR-23a促进体外培养的水牛GCs凋亡,降低E2分泌而促进P4的分泌;相反,CELF1促进体外培养的水牛GCs增殖,提高E2分泌但降低P4的分泌;miR-23a通过靶向CELF1能够降低水牛GCs凋亡、促进细胞增殖和E2激素分泌;(3)miR-23a靶向CELF1可能通过抑制细胞中PI3K/AKT信号通路进而调控水牛GCs的凋亡。