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Bax基因是动物凋亡基因Bcl-2家族中的一员，具有促进动物细胞凋亡的作用。以往研究报道表明Bax基因可以诱发模式植物细胞过敏性反应和凋亡。为了探讨哺乳动物Bax基因对药用植物细胞凋亡和细胞中次生代谢产物合成的影响，本文以本实验室构建保存的转小鼠Bax基因的金丝桃细胞（雌二醇诱导型启动子）为材料，研究了小鼠Bax基因对金丝桃细胞凋亡和金丝桃苷合成的影响，并初步探讨了Bax基因诱发金丝桃细胞凋亡和金丝桃苷合成的信号转导机理，主要实验结果如下：1、转小鼠Bax基因金丝桃细胞系悬浮培养条件的优化将固体培养的转小鼠Bax基因金丝桃愈伤组织接种到MS培养液中，为获得最优细胞生物量和金丝桃苷含量，对培养液（植物激素组成、pH值和蔗糖浓度）、培养温度、摇床转速和接种量等条件进行优化，得到了金丝桃悬浮细胞系的最适培养条件：培养液为MS+1.5×10-5mol·L-1NAA+10-6 mol·L-1BA+3％蔗糖，使用前pH值调至5.8，培养温度为25℃，摇床转速为100 rpm，接种量为3g／50mL medium。并且在此培养条件下测得细胞生长周期为12 d。在优化培养条件的过程中，对传代种细胞进行Bax基因的PCR鉴定筛选，最终获得了生长速度较快、形态比较稳定的金丝桃诱导型转小鼠Bax基因悬浮细胞系。2、小鼠Bax基因对金丝桃细胞凋亡的影响及其机理的初步研究Western blotting检测结果表明，添加25μmol·L-1雌二醇（Est）可以诱导转小鼠Bax基因金丝桃细胞中Bax的稳定表达。转小鼠Bax基因金丝桃细胞经Est处理后，21h时胞外培养液pH值开始升高；用Sytox green特异性DNA染料对细胞进行染色，24h时就能检测到细胞的死亡，且随着时间的延长死亡细胞数量逐渐增加，在60～72h时可以观察到明显的细胞染色质凝集、细胞核解体形成凋亡小体等形态学上典型的凋亡特征，而对照组细胞无上述特征。此结果表明小鼠Bax基因在金丝桃细胞中的诱导表达可以诱发细胞凋亡。DNA琼脂糖凝胶电泳结果表明，经Est处理48h后的转Bax基因金丝桃细胞的基因组出现明显的“DNA Ladder”，而对照组细胞检测不到“DNA Ladder”，表明小鼠Bax基因的诱导表达可以诱发核小体间的DNA发生断裂。此结果进一步证实小鼠Bax基因可以诱发金丝桃细胞凋亡。为了探讨小鼠Bax基因诱发金丝桃细胞凋亡的分子机理，本文测定了金丝桃细胞中一氧化氮（NO）的含量。试验结果表明，Est处理后12h，转基因金丝桃细胞的NO含量开始出现增加，并且在第25h左右达到第一个高峰，随后出现小幅下降，在大约33h左右又开始快速增加并在40h左右达到第二个高峰，而对照组细胞的NO含量未出现明显变化。试验结果表明，小鼠Bax基因的诱导表达可以诱发金丝桃细胞NO进发。NO专一性淬灭剂cPTIO在淬灭NO进发的同时，也抑制了由Bax诱发的细胞凋亡，说明NO是参与Bax诱发金丝桃细胞凋亡所必需的信号分子。DPI是质膜NADPH氧化酶的专一性抑制剂，可以抑制细胞的氧化进发。本文试验结果表明，DPI处理虽然不能抑制Bax诱发的金丝桃细胞凋亡和核DNA断裂，但可以推迟细胞凋亡和“DNA Ladder”的出现时间，说明由质膜NADPH氧化酶介导的氧化进发作用可能参与了Bax对金丝桃细胞凋亡的促进作用，但不是Bax诱发细胞凋亡的必需信号转导事件。3、小鼠Bax基因对金丝桃苷合成的影响及其机理的初步研究在未诱导Bax基因表达的前提下，转小鼠Bax基因金丝桃悬浮细胞和野生型金丝桃悬浮细胞，在细胞生长和金丝桃苷合成积累上没有区别。在转Bax金丝桃悬浮细胞生长周期的不同时间段添加Est进行Bax的诱导表达，发现细胞生长对数期末期（第9 d）为促进金丝桃苷合成积累的最佳诱导时期，第12 d收获得鲜重为对照的94％，金丝桃苷含量达到了对照的2.15倍。在Bax诱导金丝桃苷合成的过程中，悬浮培养的金丝桃细胞发生了NO进发事件。NO专一性淬灭剂cPTIO可以有效的消除Bax诱发的NO进发，并且在一定程度上抑制了Bax诱导金丝桃苷的合成；外源NO也可以诱导金丝桃细胞中金丝桃苷的合成，cPTIO能抑制外源NO诱导金丝桃苷的合成。此结果表明NO介导了一条Bax诱导金丝桃苷合成的信号途径。质膜NADPH氧化酶的专一性抑制剂DPI对Bax诱导金丝桃苷的合成也有一定的抑制作用。通常，在植物细胞中，质膜NADPH氧化酶介导的氧化进发的直接产物主要为H2O2。外源添加H2O2能够有效的诱导金丝桃细胞中金丝桃苷的合成。过氧化氢酶（CAT）类似于DPI可以在一定程度上抑制Bax诱导金丝桃苷的合成，而CAT对外源NO诱导金丝桃苷的合成无抑制作用。NO专一性淬灭剂cPTIO对外源H2O2诱导金丝桃苷的合成也无抑制作用。综上所述，可以推测在转Bax基因金丝桃细胞中，NO和由质膜NADPH氧化酶介导而产生的活性氧类物质（eg.H2O2）可能通过两条独立的信号途径介导Bax诱导金丝桃苷的合成。