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热应激是当前南方地区最重要的应激性致病因素,系统阐述热应激致病过程中重要分子的功能,不仅可为育成具有明显耐热特性的品种(系)提供可供选择的分子素材,还为热应激的综合防控提供理论依据。鉴于此,本研究:克隆了猪细胞因子信号抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)和SOCS4 c DNA开放阅读框(ORF)序列,并分析其分子结构特征;荧光定量PCR检测了SOCS3和SOCS4在热应激猪不同组织的表达谱;利用HSP70过表达构建体外热应激模型,观察了增高和降低SOCS3和SOCS4表达对HEK293T细胞及IPEC-J2细胞核因子-κB(NF-κB)的活性影响;Western blot检测了NF-κB信号通路中几种关键分子的表达变化,结果表明:(1)猪SOCS3基因c DNA序列ORF长690 bp,编码229个氨基酸的前体蛋白。与八眉猪的氨基酸序列一致性最高,为98.2%。该蛋白分子量25.1 k Da,等电点(PI)8.84,具有SOCS家族特异的中央SH2区、C末端40个氨基酸的SOCS Box区及12个氨基酸的KIR结构区。荧光定量PCR结果显示,肠系膜淋巴结中SOCS3 m RNA在热应激的第3、6和9天显著下调(P≤0.05)。在胸腺和小肠粘膜中,尽管在第3天呈下降趋势,但在第6和第9天显著上调(P≤0.05)。NF-κB活性检测结果表明,猪SOCS3负向调控HSP70介导的NF-κB的活化,且TNF-α能使这种活化作用放大。Western blot结果显示,SOCS3通过降解Mal蛋白的表达,抑制了IκB-α的磷酸化而负向调控HSP70介导的NF-κB活化。(2)猪SOCS4基因的开放阅读框(ORF)长1326bp,编码441个氨基酸,与长白猪的氨基酸序列同源性为100%,牛和山羊次之,均为96.1%。其蛋白分子量为50.5 k Da,等电点(PI)为6.60,具有长度为285个氨基酸的无明显蛋白结合基序的N末端。荧光定量PCR结果显示,热应激条件下,在胸腺和肠系膜淋巴结组织上,SOCS4 m RNA表达量明显上调,其中,第3、9天在胸腺组织上显著上调(P≤0.05),在肠系膜淋巴结组织上第1、6天极显著上调(P≤0.01)。而在小肠和脾脏组织,SOCS4m RNA表达量变化不显著。NF-κB活性检测结果表明,猪SOCS4负向调控HSP70介导的NF-κB的活化,TNF-α能使这种活化作用放大。Western blot结果显示,SOCS4能通过抑制IκB-α的磷酸化而抑制HSP70介导的NF-κB活化,且这种活化不依赖于Mal蛋白的降解。该研究成功克隆了猪SOCS3和SOCS4基因,发现其有明显的热应激响应,并呈组织和时间依赖性。SOCS3通过降解Mal而抑制IκB-α的磷酸化,从而负向调控HSP70介导的NF-κB活化。SOCS4可通过抑制IκB-α的磷酸化而负向调控HSP70介导的NF-κB活化,但呈Mal非依赖性。