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背景和目的肝细胞癌是全球第五大常见癌症,每年因肝细胞癌的死亡人数超过600,000,占肿瘤死亡人数的三分之一,它是全球较为严重的健康问题。肝细胞癌的发生是由许多因素参与的复杂过程,这些因素包括遗传改变,某些蛋白异常表达,肿瘤抑制因子的突变,癌基因的过度表达等。目前已经确定肝细胞癌的发生与许多信号通路相关,如Wnt信号通路、MAPK信号通路、TGFβ信号通路、NF-κB信号通路等。其中,TGF-β信号参与肝脏疾病进展的所有阶段,从最初的肝损伤到炎症、纤维化、肝硬化以及肿瘤的发生均有所参与。研究表明,TGF-β信号通路在包括肝癌在内的多种肝脏疾病中发挥重要调控作用。最近的研究发现SCUBE3(信号肽-CUB-EGF样结构域蛋白3)可以通过与TGF-β受体结合从而触发下游信号通路参与调控多种生物学过程。研究表明,SCUBE3可以通过调控TGF-β介导的信号转导参与小鼠心脏肥大和胚胎发育。另外,有研究表明SCUBE3参与多种肿瘤的生物学过程,例如,SCUBE3通过调控肺癌的血管生成和通过促进上皮的间充质转化从而促进非小细胞肺癌发生转移和侵袭,SCUBE3也可以促进骨肉瘤细胞的增殖且与骨肉瘤患者生存预后相关。然而,目前有关SCUBE3在肝癌中的表达及生物学功能尚不清楚。本研究通过构建SCUBE3敲减的人肝癌细胞细胞系,通过小鼠皮下种植,基因表达谱芯片,免疫共沉淀,Western Blot等一系列检测手段研究其对肝癌细胞增殖的调控效应。方法第一部分:(1)本研究首先利用qRT-PCR和Western blot检测人肝癌细胞株Bel7404、Bel7402、HepG2、SMMC7721和人正常肝细胞株LO2中SCUBE3的表达。(2)体外实验:通过慢病毒载体转染技术构建SCUBE3敲减的Bel7404细胞模型,通过MTT实验、EDU实验检测SCUBE3对肝癌细胞增殖的影响。通过Annexin V-APC&PI双染法、Caspase3/7活性检测探讨其对肝癌细胞凋亡的影响。另外,通过流式细胞仪检测SCUBE3对肝癌细胞周期的影响。(3)体内实验:通过裸鼠皮下成瘤模型探讨SCUBE3对肝癌细胞体内增殖的影响。第二部分:(1)利用Affymetrix基因表达谱芯片筛选出SCUBE3敲减后的差异表达基因:为探索SCUBE3促进肝癌细胞增殖的分子机制,首先利用Affymetrix基因表达谱芯片筛选出SCUBE3敲减后的差异表达基因,并进行一系列的生物信息学分析包括绘制散点图、火山图、层次聚类分析、疾病与功能的富集等对差异基因的功能进行分析。(2)鉴定SCUBE3调控的下游靶分子:首先在差异表达的基因中找出与调控细胞周期密切相关的基因并通过Western blot进行验证,旨在确定SCUBE3的下游靶分子。通过慢病毒转染技术敲减下游调控靶分子,随后探讨下游靶分子对肝癌细胞增殖,凋亡,周期的调控效应,随后通过共转染技术对肝癌细胞同时进行SCUBE3的敲减和下游调控靶分子的过表达,检测分析肝癌细胞增殖,凋亡,周期的变化。(3)探索SCUBE3调控下游靶分子的分子机制:首先利用免疫共沉淀技术验证SCUBE3是否可以与TGFβRII受体结合。另外,SCUBE3敲减后的差异表达基因进行通路富集,筛选出关键信号通路并通过western blot进行验证关键分子的表达。结果第一部分:(1)SCUBE3在肝癌细胞中的表达高于正常人肝细胞,且在肝癌细胞系BEL7404中表达最高。(2)体外实验:MTT实验和EDU结果表明SCUBE3敲减可显著抑制肝癌细胞的体外增殖能力;细胞凋亡检测和Caspase3/7活性检测结果表明SCUBE3敲减可显著促进肝癌细胞发生凋亡;细胞周期检测结果显示SCUBE3敲减显著抑制肝癌细胞由G1期向S期的转化。(3)体内实验:裸鼠活体成像结果显示SCUBE3敲减组的荧光值显著低于对照组;SCUBE3敲减组裸鼠皮下瘤体的体积增长曲线显著低于对照组,SCUBE3敲减组裸鼠皮下瘤体的质量显著低于对照组。第二部分:(1)利用Affymetrix基因表达谱芯片共筛选出405个上调基因和489个下调基因。(2)在芯片筛选出的差异蛋白中找出与细胞周期相关的蛋白,其中CCNL2、CDK6、CCNE1、CCND1差异显著,Western Blot验证结果与芯片结果一致。由于CCNE1变化最为明显,因此本研究将其作为SCUBE3下游调控的候选靶分子。根据分子柯霍氏法则,一方面在BEL7404细胞中敲减CCNE1并进行一系列细胞增殖,细胞凋亡检测,细胞周期检测等实验,结果表明敲减CCNE1可抑制肝癌细胞的增殖,促进肝癌细胞凋亡,抑制肝癌细胞的G1/S期的转化,表明敲减CCNE1对肝癌细胞增殖的影响与敲减SCUBE3相同;另一方面对肝癌细胞敲减SCUBE3的同时过表达CCNE1,结果发现过表达CCNE1回复SCUBE3敲减对肝癌细胞增殖、凋亡和周期的影响,提示SCUBE3很可能是通过调控CCNE1表达促进肝癌细胞增殖。(3)我们对表达谱芯片筛选出的差异基因进行通路富集分析,结果显示TGFβ信号通路和PI3K/AKT信号通路变化明显。由于PI3K/AKT信号通路本身就是TGFβ非经典信号通路之一,因此本研究利用免疫共沉淀检测发现SCUBE3可与TGFβRII受体结合。Western blot结果显示SCUBE3敲减可抑制肝癌细胞PI3K/AKT信号通路,同时可抑制GSK3β的磷酸化从而抑制其激酶活性。结论1.与正常人肝细胞相比,人肝癌细胞高表达SCUBE3。2.SCUBE3可能是通过结合TGFβRII受体激活PI3K/AKT通路,进而磷酸化GSK3β抑制其激酶活性,从而引起CCNE1的泛素化降解减少并导致CCNE1的累积,最终促进肝癌细胞的增殖。