论文部分内容阅读
家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)属于杆状病毒科核型多角体病毒属。家蚕核型多角体病毒(以下简称家蚕杆状病毒)是感染家蚕的重要病原体,我国家蚕养殖业每年因此遭受巨大经济损失。对于家蚕杆状病毒基因功能的探索是近些年来研究热点之一,但是依然存在很多功能未知的基因。本研究就家蚕杆状病毒的功能未知基因bm64开展研究。通过对NCBI上发布的Bm NPV(T3株)全序列(Gen Bank No.L33180.1),进行生物信息学分析,寻找bm64基因序列并进行比对和结构域预测。结果表明bm64与Ac MNPV同源序列的同源性高达95%,Bm64蛋白含有一段疏水结构域(62~84 aa)。通过构建p GEX-4T-3-bm64,转化至Rosetta菌株,诱导表达Bm64蛋白,亲和纯化该蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,获得多克隆抗体。使用该抗体成功检测到Bm NPV感染Bm N细胞后产生Bm64蛋白。通过间接免疫荧光检测发现Bm NPV感染细胞后Bm64蛋白主要定位于细胞核内。因此,推测bm64基因可能在病毒DNA复制和转录过程中起一定的作用。通过实时定量PCR对该基因的转录时相进行检测,发现bm64基因的转录时相与晚期基因vp39相似,推测该基因为晚期基因。为阐明bm64基因功能,利用Red同源重组系统和Bacmid杆粒构建bm64缺失型重组杆状病毒,探索其基因缺失对病毒复制的影响。通过Bac-to-Bac系统将bm64基因及其启动子进行异位补回,构建基因回复的重组杆粒。将egfp与ph基因通过Bac-to-Bac系统重组入Bacmid中,构建三种不同Bacmid(Bacmid-egfp-ph、Bacmid-⊿bm64-egfp-ph、Bacmid-bm64rep-egfp-ph)。Western Blot验证基因缺失重组病毒不表达Bm64蛋白。将三种杆粒转染细胞,发现bm64基因缺失后重组病毒导致细胞病变的时间明显延迟,而TCID50检测也表明病毒滴度下降,而基因补回的重组病毒感染细胞后的病毒滴度达到野生病毒水平。因而,推测bm64基因是病毒复制的非必需基因,但是bm64基因在病毒复制感染中起重要作用。Real-time PCR检测显示bm64缺失的重组杆状病毒的早、晚、极晚期基因lef-3、vp39、p10转录水平均有不同程度的降低。本研究对bm64基因的转录时相、原核表达和亚细胞定位等方面进行研究,通过对基因缺失的重组杆状病毒进行病毒滴度、病毒DNA复制、转录及蛋白表达检测,推测bm64基因能影响病毒复制,是病毒复制的非必需基因,其确切机制有待深入研究。