解淀粉芽孢杆菌GGT在B.subtilis中的表达及其合成L-茶氨酸的研究

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γ-谷氨酰基转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT)广泛存在于生物体中,GGT能够催化γ-谷氨酰基转移到氨基酸或肽上。微生物来源的GGT底物特异性更广,这意味在其催化下能够合成多种γ-谷氨酰基氨基酸衍生物或肽,这些酶促合成产物在医药食品领域具有重要应用价值。例如GGT能够以L-谷氨酰胺和乙胺为底物,催化合成L-茶氨酸。L-茶氨酸是茶叶中的一种主要氨基酸,它具有去苦提鲜改善食品风味的功能,在药品及保健品领域具有极高的开发价值。国内外对于L-茶氨酸的需求日益剧增,人们也更加关注高品质GGT的制备。本研究以解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens BH072)GGT为研究对象,将其基因导入到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中,成功实现重组GGT在B.subtilis 168中的高效分泌表达及纯化,并对重组酶的酶学性质进行研究分析,最后利用重组酶实现了L-茶氨酸的生产。主要实验结果如下:(1)提取B.amyloliquefaciens BH072基因组DNA,以其为模板,扩增ggt-6his/ggtΔsp-6his基因,然后将基因片段连接至穿梭质粒p HT43上,置于诱导型启动子Plac和信号肽spAmy Q下游。将连接产物导入到大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)中,构建获得重组菌株,提取质粒,获得重组质粒p HT43-spAmy Q-ggt-6his/p HT43-sp Amy Q-ggtΔsp-6his,再通过电转化导入到B.subtilis 168中,获得重组菌株B.subtilis 168(p HT43-sp Amy Q-ggt-6his/p HT43-sp Amy Q-ggtΔsp-6his)。通过IPTG诱导重组菌表达重组GGT,然后经镍柱亲和层析收集纯化重组蛋白,SDS-PAGE电泳显示双信号肽(spAmy Q-sp GGT)和单信号肽(spAmy Q)均能成功介导重组酶胞外分泌表达。同等条件下双信号肽介导的重组酶表达量更高,说明双信号肽能够更高效地介导重组酶分泌表达。对分泌表达的重组酶进行酶活性检测,发现重组酶具备活性,说明在介导重组酶分泌表达后,其N端信号肽部分被B.subtilis 168所分泌的细胞外蛋白酶或肽酶降解。(2)对重组菌进行诱导条件优化,在终浓度为80μM IPTG下诱导表达24 h时,重组菌获得最高产量的重组酶,测得纯化收集后重组酶浓度为90±0.2 mg/L,比酶活为55±0.5 U/mg,且重组酶的表达不会对宿主菌产生影响。将收集纯化的重组酶进行酶学性质研究,在40℃和p H 9.0的条件下重组酶转肽活性最高;其最适存储条件为40℃和p H 8.0,该条件下重组酶能够稳定储存。动力学参数测定显示,以γ-谷氨酰对硝基苯胺为底物时,米氏常数Km为0.214 m M,最大反应速率Vm为88.13μmol/min/mg。(3)利用重组酶催化底物L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐合成L-茶氨酸,通过UPLC-MS检测分析,确定产物中含有L-茶氨酸。通过邻苯二甲醛柱前衍生化法检测反应底物及产物,成功确定主要物质的出峰时间,然后通过对不同条件下L-茶氨酸的转化率进行检测来优化酶促反应条件。在重组酶终浓度为0.5 U/m L,L-谷氨酰胺终浓度为20 m M,乙胺盐酸盐终浓度为100 m M(即底物比例1:5),酶促反应时间为6 h的条件下,重组酶催化合成L-茶氨酸的转化率最高,转化率为48.2%。
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