爪哇根结线虫发育相关基因的鉴定

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本研究首次对爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)卵相对二龄幼虫期差异表达的基因进行分离;并利用同源克隆的方法对爪哇根结线虫和松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的G蛋白B亚基的编码基因进行了克隆;运用原位杂交和RNAi技术对发育相关基因的表达、组织定位及相关功能进行了研究。取得以下结果: 1.利用抑制差减杂交技术(SSH),以爪哇根结线虫卵的cDNA为检测子(tester),二龄幼虫的cDNA为驱赶子(driver),构建卵的差异性表达cDNA差减文库。对该cDNA文库按片段进行克隆,挑取了576个菌落,以卵的cDNA和二龄幼虫的eDNA为探针,利用反向Northern杂交筛选出59个强信号的阳性克隆。对筛选的阳性克隆进行测序,获得26个假定发育相关基因的EST序列,其中未知基因4个,假定蛋白11个,已知基因11个。并利用RACE技术获得了轻链肌球蛋白编码基因的cDNA序列。本研究是对植物寄生线虫发育相关基因的首次筛选,为根结线虫的发育基因的研究打下了基础。 2.利用简并引物扩增和RACE技术,从爪哇根结线虫和松材线虫中克隆获得在线虫发育过程中起重要调控作用的G蛋白β亚基编码基因MJGpb1和.BXGpb1。MJGpb1的cDNA的全长由1023个核苷酸组成;BXGpb1的cDNA的全长由1029个核苷酸组成。均含有哺乳动物Gβ1亚基保守的功能区域。通过BLASTX比对,发现该蛋白具有较高的保守性,并与多个物种的G蛋白同源,其中与秀丽小杆线虫的亲源关系最近,同源性分别为96%和82.%。另外通过特异性扩增得到MJGpb1和BXGpb1的基因组编码区,MJGpb1大小为2466bp,编码区内含7个外显子,6个内含子。7个外显子的大小依次为57、210、260、202、115、102和107bp; 6个内含子的大小分别为310、608、49、382、50和44bp。BXGpb1大小为1269bp,包含3个外显子,2个内含子。3个外显子的大小依次为488、317和244bp;2个内含子的大小分别为124和116bp。该基因的克隆为其基因结构分析及其在植物寄生线虫中的功能研究打下了基础。 3.运用原位技术分析SSH筛选出来的与核糖体蛋白同源的rpl-MJ序列和MJGpb1的表达情况和组织定位。结果表明,rpl-MJ序列在胚胎发育期表达量较高,主要集中在细胞核,幼虫期在食道腺细胞核周围和生殖腺细胞中有少量表达。MJGpb1在卵期主要分布在细胞的两极;幼虫期在神经系统、排泄系统、肌肉组织中均有表达。 4.利用长链dsRNA对爪哇根结线虫的MJGpb1进行沉默,首次在植物寄生线虫中研究该基因的主要功能。结果显示,经过长链dsRNA浸泡的爪哇根结线虫的卵会发生滞育现象,滞育时间可达48h。经过浸泡处理过的二龄幼虫24h后行动变得迟缓,S型运动比较缓慢,干扰效率为43.9%;36h后二龄幼虫的行动方式由S型运动变成了U型运动,干扰效率为48.5%;48h后虫体只剩下头部和少部分的尾部能够活动,干扰效率为64.1%;60h后二龄幼虫就开始逐步死亡,干扰效率为84.2%。利用RT-PCR检测干扰效率,结果表明处理过的卵和二龄幼虫的MJGpb1 表达量只有对照的10%和5%。 本研究通过对爪哇根结线虫发育相关基因的研究,筛选了相关基因及序列,并对相关基因的表达和功能作了研究,这在国内外还是首次报道。本研究为根结线虫的抗性育种及防治开辟新的途径,提供了新的理论依据。
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