论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗称猪蓝耳病,该病病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus,PRRSV),临床以妊娠母猪流产、死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍表现、不同年龄猪只呼吸系统疾病和高死亡率为主要特征。自1987年爆发以来,给世界范围内的养猪业造成了巨大的经济损失。我国于1996年首次爆发该病,迅速蔓延全国,成为我国猪繁殖障碍疾病的主要病原。2006年,我国爆发以高热(≧41o)、高发病率(50-100%)和高死亡率(20-100%)为特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS),给养猪业造成巨大经济损失。至今,HP-PRRS仍是危害我国养猪业的头号疫病。由于PRRSVRNA聚合酶的保证性较低,造成病毒复制过程中非常容易发生RNA错配和抗原漂移,导致产生大量变异毒株,影响PRRS的防控。因此及时监测PRRSV在我国规模化猪场中的流行和变异情况,对有效防控PRRS具有十分重要的指导意义。为研究PRRSV在规模化场的感染情况及遗传演化规律,本研究共采集某猪场具有PRRS疑似症状的754份血清和21份死亡仔猪的肺脏进行血清抗体检测,病毒分离鉴定,基因序列分析和特征毒株的生物学特性研究。病原学和血清学检测表明,该猪场PRRSV抗体阳性率达到91.9%,公猪、母猪、哺乳仔猪和育肥猪的抗体阳性率分别为100%(7/7)、97.38%(149/153)、98.04%(201/205)和95.08%(115/120)。断奶仔猪、后备母猪和育成猪的抗体阳性率分别为83.55%、81.82%和80%。通过RT-PCR检测从775份样品中确定104份样品为PRRSV阳性,为了排除阳性样品中的疫苗毒株,利用疫苗毒株在猪肺泡巨噬细胞(PAM)上连续传代2代后就不再复制的特性,将104份阳性样品全部接种PAM并盲传5代,通过RT-PCR检测分离出34份PRRSV野毒株。序列比对后发现34个样品中存在14个野毒株。全基因组序列分析发现,14个毒株的核苷酸同源性从95.2%-99.5%,平均同源率在96%左右,平均差异度达3.44%,毒株间最大差异为4.7%,最小差异0.5%。NSP2基因分析表明,A1-A13 13个毒株均在NSP2的481位缺失1个氨基酸,533-561位缺失29个氨基酸,完全符合HP-PRRSV 30个不连续氨基酸缺失的分子特征;Henan-A14除了533-561存在29个氨基酸缺失外,其472-520位还存在48个氨基酸的缺失。上述结果表明14个分离毒株均为HP-PRRSV。将14株病毒与Gene Bank中62个不同时期分离的美洲型PRRSV代表毒株分析发现,76个PRRSV可分为六个亚群,1、2亚群为经典PRRSV毒株,3、4、5、6亚群主要为HP-PRRSV毒株。本研究分离的14株病毒处于3个亚群,分为2个明显不同的进化方向。其中,A1位于5亚群,A3-4,A9-14 8个毒株处于亲缘关系较远的6亚群,A2,A5-8 5个毒株处于3亚群。分离毒株的细胞嗜性和抗原性研究表明,14个毒株均能在PAM细胞上生长复制,与强毒Hu N4株相比,2株病毒的复制能力增强,1株病毒的复制能力下降。与此相反,5株病毒不能在MARC-145细胞中复制,3株病毒在MARC-145细胞上的复制能力显著降低,与之前的研究结果存在显著差异,表明分离毒株的细胞嗜性发生较大改变,可能对今后弱毒疫苗的研制和病毒分离制造困难。以Hu N4疫苗株制备的血清在PAM上对分离毒株进行中和试验,评估分离毒株的中和抗原是否发生改变。结果表明,4株病毒的中和抗原与HuN4存在巨大差异,高免血清不能中和这些毒株,5株病毒的中和效价比Hu N4显著降低,说明分离毒株的中和抗原与HuN4疫苗毒株存在较大差异,可能会影响疫苗免疫的保护效果。序列分析发现,2个毒株基因组中ORF2a的246位氨基酸的密码子TTA突变为终止密码子TAA,导致其编码的GP2蛋白的C末端提前终止,其编码的蛋白大小由正常的256个氨基酸缩短为246个氨基酸。1个毒株的NSP2区除了缺失29个氨基酸之外,还缺失48个氨基酸。上述3个毒株的生物学特性和抗原性均发生了改变:ORF2a缺失毒株不能在MARC-145细胞上生长复制,NSP2缺失毒株在该细胞的复制能力显著下降。此外,这3株病毒对Hu N4高免血清的中和效价发生较大变化,1株病毒不能中和,2株病毒的中和效价显著降低。为了研究ORF2a和GP2部分缺失对其细胞嗜性和抗原性的影响,以感染性克隆r Hu N4-F112为骨架,分别拯救出ORF2a和GP2部分缺失的重组病毒r Hu N4-F112-ΔGP2和r HuN4-F112-D48,分别在MARC-145细胞上对其生长特性及中和抗原进行分析。结果表明,重组病毒r Hu N4-F112-ΔGP2的生长特性和中和效价与亲本毒株r Hu N4-F112没有明显差异,说明GP2 C末端10个氨基酸的缺失,不影响重组病毒在MARC-145细胞上的生长复制,也不改变重组病毒的中和抗原。对重组病毒r Hu N4-F112-D48的研究表明,重组病毒r HuN4-F112-D48的生长特性和中和效价与亲本毒株r Hu N4-F112没有明显差异,说明NSP2高变区48个氨基酸的缺失,不影响重组病毒在MARC-145细胞上的生长复制,也不改变重组病毒的中和抗原。以上结果与基因缺失毒株的生物学特性结果截然相反,说明基因缺失毒株的生物学特性的改变,需要进行进一步研究和探讨。本研究在一个猪场分离出属于3个基因亚群的14株HP-PRRSV,发现分离毒株对MARC-145的细胞嗜性发生改变,与Hu N4疫苗株的中和抗原存在较大差异,表明猪场内PRRSV的演化具有多样性和复杂化的特点。3个毒株的ORF2a和NSP2发生部分缺失,利用缺失相应基因的重组病毒对其生物学特性进行验证,发现ORF2a和NSP2基因的部分缺失不影响重组病毒在MARC-145细胞的复制,也不改变病毒的中和活性。上述发现对研究PRRSV的遗传变异规律,掌握变异毒株的分子特征、流行特点及疫情快速诊断具有指导意义。