精氨酸酶Ⅱ(arginaseⅡ,Arg-Ⅱ)是精氨酸酶家族中的一种,目前已经发现的精氨酸酶有Ⅰ和Ⅱ两种亚型,两者具有相似的结构特征和酶特性,它们主要参与了有机体的尿素循环,其区别在于各自的亚细胞定位、组织分布和免疫反应不同。近期研究发现精氨酸酶Ⅱ在免疫反应中也发挥了重要作用。核受体超家族由甾体激素、甲状腺激素、维甲酸等化学信号的受体及配体未明的多种孤儿受体组成,该家族成员的主要功能是作为配体激活的转录因子,调控代谢、发育、生殖相关基因的表达。肝X受体(liver X receptor,LXR)属于核受体超家族成员,不仅在脂质代谢中发挥重要的作用,而且在调控巨噬细胞的炎症反应和免疫应答中发挥着重要作用。ArgⅡ是巨噬细胞中LXRs的靶基因,LXRs上调精氨酸酶Ⅱ,ArgⅡ可以与iNOS竞争性催化底物精氨酸,减少一氧化氮的合成,发挥抗炎效果。牙鲆(Paralichthys olivaceus)俗称牙片、比目鱼、偏口等,是中国重要的海水养殖鱼类之一。因其具有极好的营养价值与经济价值而受到大家的喜爱。但是,由于过度捕捞使野生牙鲆数量锐减,同时工厂化养殖近亲繁殖严重,使得种质资源严重退化。而传染病造成的牙鲆大面积死亡现象时有发生,也给养殖场造成了巨大的损失。所以从鱼类的自身免疫调控入手,对其细菌感染的分子机制进行深入研究显得尤为重要。本论文的主要研究从牙鲆中克隆得到免疫基因LXR,以及它的受体靶基因精氨酸酶Ⅱ基因,并研究两种编码蛋白潜在的免疫功能。本实验对鱼类中LXR基因及其受体靶基因精氨酸酶Ⅱ进一步的的研究,为牙鲆免疫机制探讨以及后期更深入的研究奠定了重要的基础。1精氨酸酶Ⅱ的克隆与表达分析本实验通过基因克隆的方法,得到牙鲆(Paralichthys olivaceus)Arg-Ⅱ基因cDNA,其全长1882bp,包含1053bp开放阅读框,编码350个氨基酸,预测分子量为38.02KD,等电点为6.42。牙鲆Arg-Ⅱ基氨基酸的结构预测显示,牙鲆Arg-Ⅱ基因编码的氨基酸序列具有典型的精氨酸酶结构特征,推测与哺乳动物中的功能类似。系统进化分析表明,鱼类Arg-Ⅱ基因合成一簇,其中Arg-Ⅱ基因与鲈鱼(Lates calcarifer)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、半滑舌蹋(Areliscus semILaevi)的相似度最高,分别为93%、90%、88%。实时荧光定量结果表明,Arg-Ⅱ基因在健康牙鲆的肝、脾和鳃等免疫组织中高表达。进一步研究发现,经迟缓爱德华氏菌感染的牙鲆成鱼中,主要免疫组织Arg-Ⅱ基因mRNA的表达量在细菌感染后6~12 h显著上调,随后表达量恢复正常。离体培养的牙鲆巨噬细胞经迟缓爱德华氏菌感染后,Arg-Ⅱ基因的表达也呈显著上调模式。因此,本研究证明Arg-Ⅱ基因参与牙鲆响应迟缓爱德华氏菌感染的免疫过程,揭示Arg-Ⅱ基因可能在牙鲆抗病免疫过程中发挥了重要作用。2肝细胞受体X的克隆与表达分析本实验通过基因克隆的方法,得到牙鲆(Paralichthys olivaceus)精氨酸酶Ⅱ的目标基因肝脏X受体(LXR)的全长cDNA基因序列。结果显示:LXR基因由1742个核苷酸组成,包含一个开放阅读框,编码470个氨基酸。分子量预测53.34KD,等电点为6.09。氨基酸的多重比对结果显示,牙鲆LXR基氨基酸的结构预测显示,牙鲆LXR基因的氨基酸,LXR有三个保守结构域:ZnF_c4结构域,TNFR结构域和HOLI结构域,具有典型的孤核受体家族序列特征。系统进化树分析表明,鱼类的LXR基因聚合成一个大簇,牙鲆LXR基因与石斑鱼(Epinephelussp)、罗非鱼(Oreochromis spp)的相似度最高,分别为93%、92%。实时荧光定量PCR检测结果表明,牙鲆LXR基因在健康牙鲆的肝、脾、鳃、脑等组织中高表达。迟缓爱德华氏菌感染牙鲆成鱼4种免疫相关组织和离体培养的头肾和淋巴细胞,LXR基因的mRNA的表达量在细菌感染后6~12 h也显著上调,随后表达量恢复正常。通过参考精氨酸酶Ⅱ基因的mRNA在感染迟缓爱德华氏菌之后的相对表达量,与肝受体X的趋势比较一致,结合相关文献的记载,更加确认ArgⅡ是巨噬细胞中LXRs的靶基因。综上所述:牙鲆LXR基因的表达与爱德华氏菌感染密切相关,揭示了LXR基因可能在牙鲆的感染免疫应答中发挥重要作用。