论文部分内容阅读
目的:原发性肝细胞肝癌(HCC)在世界上最常见的恶性肿瘤中排位第五,在我国癌症病死率中位居第二位。目前,肝癌的分子靶向治疗逐渐引起人们的重视,及时发现潜在的治疗靶点可能为肝癌的分子靶向治疗带来新的突破。泛素水解酶22(Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase22,USP22)是新发现的泛素水解酶家族成,可作用于泛素-蛋白酶体系统中泛素化的蛋白底物,通过切断泛素链与底物蛋白之间的连接,而发挥广泛的生物学功能,其已证明与多种肿瘤恶性程度、增殖、转移及预后相关,其在肝癌中的表达情况尚不清楚。本实验检测了USP22mRNA及蛋白在肝癌组织及细胞中的表达水平,探讨USP22基因表达的高低对肝细胞性肝癌患根治术后无复发生存时间(RFS)和总生存时间(OS)的影响及其临床价值,设计并合成了针对USP22基因的特异性siRNA,并转染人肝癌细胞系HepG3B,沉默USP22基因在HepG3B细胞中的表达,初步探讨USP22基因对肝癌HepG3B细胞增殖、细胞凋亡以及细胞周期的影响。方法:1.于桂林医学院附属医院2003年5月至2008年5月间手术切除的标本,选取104例肝细胞癌组织及对应的癌旁组织,6例正常的肝组织(来自肝血管瘤患者),用免疫组化检测泛素水解酶22(USP22)在肝癌组织及相应癌旁组织中的表达情况。2.提取112例肝细胞癌组织及对应的癌旁组织,6例正常的肝组织中总RNA,RT-PCR检测泛素水解酶22(USP22)在肝癌组织、相应癌旁组织及正常肝组织中的表达情况,使用Image-J软件检测积分灰度值(integrateddensity value)计算后得出肝癌组织、相应癌旁组织及正常肝组织中泛素水解酶22(USP22)的相对表达水平,分析其中的差异。3.提取112例肝细胞癌组织及对应的癌旁组织,6例正常的肝组织中总蛋白质,Western blot检测泛素水解酶22(USP22)在肝癌组织、相应癌旁组织及正常肝组织中的表达情况,使用Image-J软件检测积分灰度值(integrated density value)计算后得出肝癌组织、相应癌旁组织及正常肝组织中泛素水解酶22(USP22)的相对表达水平,分析其中的差异。4.采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析USP22基因表达强弱的分界点,将患者分为高表达组和低表达组,对高表达组和低表达组患者无复发生存时间(RFS)和总生存时间(OS)的关系进行单因素Kaplan-Meier分析和多因素Cox回归分析。5.常规培养肝癌细胞HepG2、HepG3B、Bel-7402及正常肝细胞Chang Liver。取处于对数生长期的细胞,Trizol试剂提取总RNA,RT-PCR检测泛素水解酶22(USP22)在上述肝癌及正常肝细胞中的表达情况,使用Image-J软件检测积分灰度值(integrated density value)计算后得出人肝癌细胞HepG2、HepG3B、Bel-7402及人正常肝细胞Chang liver中泛素水解酶22(USP22)的相对表达水平,分析其中的差异。6.提取处于对数生长期的肝癌细胞HepG2、HepG3B、Bel-7402及正常肝细胞Chang Liver中总蛋白质,Western blot检测泛素水解酶22(USP22)在肝癌细胞及正常肝细胞中的表达情况,使用Image-J软件检测积分灰度值(integrated density value)计算后得出人肝癌细胞HepG2、HepG3B、Bel-7402及人正常肝细胞Chang liver中泛素水解酶22(USP22)的相对表达水平,分析其中的差异。7.通过Ambion网站设计针对泛素水解酶22(USP22)基因的特异性siRNA序列,并由上海吉玛公司合成。采用处于对数生长期的肝癌细胞HepG3B,接种于6孔板中,待细胞铺满孔后用针对USP22基因的特异性siRNA合转染肝癌细胞HepG3B;8. USP22siRNA转染HepG3B细胞48h后RT-PCR及Western blot检测USP22mRNA和蛋白表达水平,使用Image-J软件检测积分灰度值(integrated density value)计算后得出转染USP22siRNA后HepG3B细胞中USP22相对表达水平的改变。9. USP22siRNA转染HepG3B细胞48h后,采用MTT法检测细胞增殖活性,计算后得出转染USP22siRNA后HepG3B细胞的生长抑制率;10. USP22siRNA转染HepG3B细胞48h后,采用流式细胞术测定细胞凋亡率和细胞周期,比较沉默USP22基因后HepG3B细胞凋亡率和细胞周期的改变;11. USP22siRNA转染HepG3B细胞48h后,采用Western blot免疫印迹检测CyclinD1、CDK4和CDK6细胞周期蛋白表达水平。结果:免疫组化结果表明泛素水解酶22(USP22)在肝癌组织中的阳性表达率明显高于相应的癌旁组织和正常肝组织(p<0.01);RT-PCR结果表明泛素水解酶22(USP22)RNA在肝癌组织中的表达明显高于相应的癌旁组织和正常肝组织;采用ROC曲线分析用来确定USP22表达量的临界值(>3与≤3)。不论是在测试集中还是在整体病人中,单因素分析显示,临床TNM分期和Edmonson grade分级均与USP22基因表达的强弱有关(均P<0.05)。多因素分析显示,当以USP22基因表达的强弱作为协变量进入Cox比例风险模型时,其为影响患者RFS和OS的独立危险因素(均P<0.001)。多元分析显示,USP22的表达高低是HCC一个独立的预后参数。Western blot结果表明泛素水解酶22(USP22)蛋白在肝癌组织中的含量明显高于相应的癌旁组织和正常肝组织;RT-PCR及Western blot检测表明人肝癌细胞HepG2、HepG3B、Bel-7402中USP22的相对表达水平显著高于人正常肝细胞Chang live;用针对泛素水解酶22(USP22)基因的特异性siRNA干扰肝癌细胞HepG3B后,HepG3B细胞中USP22表达水平明显降低;MTT法检测其细胞生长抑制率为42.24%,明显高于对照组(tsiUSP22组=22.47,p<0.01);流式细胞仪检测其细胞凋亡率为33.08%±4.53%,明显高于对照组(tsiUSP22组=12.34,p<0.01);流式细胞仪检测细胞周期,发现其处于G1期细胞的百分比为68.81%±2.71%,明显高于对照组(tsiUSP22组=33.91,p<0.01);Western blot检测发现细胞周期蛋白CyclinD1、CDK4和CDK6在USP22siRNA组中的表达水平明显低于对照组(tCyclinD1=10.85,tCDK4=10.51,tCDK6=10.59,p<0.01)。结论:泛素水解酶22(USP22)在肝癌组织中的表达明显高于相应的癌旁组织和正常肝组织;在人肝癌细胞HepG2、HepG3B、Bel-7402中USP22的表达明显高于人正常肝细胞Chang liver;USP22的表达高低是影响HCC患者预后的独立危险因素,其对HCC患者术后5年无复发生存率和总生存率的评估价值较高,为HCC患者的危险度分级及制订合理的治疗方案提供了参考意见;采用针对泛素水解酶22(USP22)基因的特异性siRNA序列转染HepG3B细胞后,可抑制肝癌HepG3B细胞增殖活性,可诱导其凋亡率升高,并导致细胞周期蛋白CyclinD1、CDK4和CDK6的表达水平下降,继而引起细胞G1期细胞周期阻滞。