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目的:原发性肝细胞肝癌(HCC)在世界上最常见的恶性肿瘤中排位第五,在我国癌症病死率中位居第二位。目前，肝癌的分子靶向治疗逐渐引起人们的重视，及时发现潜在的治疗靶点可能为肝癌的分子靶向治疗带来新的突破。泛素水解酶22(Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase22,USP22)是新发现的泛素水解酶家族成，可作用于泛素-蛋白酶体系统中泛素化的蛋白底物,通过切断泛素链与底物蛋白之间的连接,而发挥广泛的生物学功能，其已证明与多种肿瘤恶性程度、增殖、转移及预后相关，其在肝癌中的表达情况尚不清楚。本实验检测了USP22mRNA及蛋白在肝癌组织及细胞中的表达水平，探讨USP22基因表达的高低对肝细胞性肝癌患根治术后无复发生存时间(RFS)和总生存时间(OS)的影响及其临床价值，设计并合成了针对USP22基因的特异性siRNA，并转染人肝癌细胞系HepG3B，沉默USP22基因在HepG3B细胞中的表达，初步探讨USP22基因对肝癌HepG3B细胞增殖、细胞凋亡以及细胞周期的影响。方法:1.于桂林医学院附属医院2003年5月至2008年5月间手术切除的标本，选取104例肝细胞癌组织及对应的癌旁组织，6例正常的肝组织（来自肝血管瘤患者），用免疫组化检测泛素水解酶22（USP22）在肝癌组织及相应癌旁组织中的表达情况。2.提取112例肝细胞癌组织及对应的癌旁组织，6例正常的肝组织中总RNA，RT-PCR检测泛素水解酶22（USP22）在肝癌组织、相应癌旁组织及正常肝组织中的表达情况，使用Image-J软件检测积分灰度值（integrateddensity value）计算后得出肝癌组织、相应癌旁组织及正常肝组织中泛素水解酶22（USP22）的相对表达水平，分析其中的差异。3.提取112例肝细胞癌组织及对应的癌旁组织，6例正常的肝组织中总蛋白质，Western blot检测泛素水解酶22（USP22）在肝癌组织、相应癌旁组织及正常肝组织中的表达情况，使用Image-J软件检测积分灰度值（integrated density value）计算后得出肝癌组织、相应癌旁组织及正常肝组织中泛素水解酶22（USP22）的相对表达水平，分析其中的差异。4.采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析USP22基因表达强弱的分界点，将患者分为高表达组和低表达组，对高表达组和低表达组患者无复发生存时间(RFS)和总生存时间(OS)的关系进行单因素Kaplan-Meier分析和多因素Cox回归分析。5.常规培养肝癌细胞HepG2、HepG3B、Bel-7402及正常肝细胞Chang Liver。取处于对数生长期的细胞，Trizol试剂提取总RNA，RT-PCR检测泛素水解酶22（USP22）在上述肝癌及正常肝细胞中的表达情况，使用Image-J软件检测积分灰度值（integrated density value）计算后得出人肝癌细胞HepG2、HepG3B、Bel-7402及人正常肝细胞Chang liver中泛素水解酶22（USP22）的相对表达水平，分析其中的差异。6.提取处于对数生长期的肝癌细胞HepG2、HepG3B、Bel-7402及正常肝细胞Chang Liver中总蛋白质，Western blot检测泛素水解酶22（USP22）在肝癌细胞及正常肝细胞中的表达情况，使用Image-J软件检测积分灰度值（integrated density value）计算后得出人肝癌细胞HepG2、HepG3B、Bel-7402及人正常肝细胞Chang liver中泛素水解酶22（USP22）的相对表达水平，分析其中的差异。7.通过Ambion网站设计针对泛素水解酶22（USP22）基因的特异性siRNA序列,并由上海吉玛公司合成。采用处于对数生长期的肝癌细胞HepG3B,接种于6孔板中，待细胞铺满孔后用针对USP22基因的特异性siRNA合转染肝癌细胞HepG3B；8. USP22siRNA转染HepG3B细胞48h后RT-PCR及Western blot检测USP22mRNA和蛋白表达水平,使用Image-J软件检测积分灰度值（integrated density value）计算后得出转染USP22siRNA后HepG3B细胞中USP22相对表达水平的改变。9. USP22siRNA转染HepG3B细胞48h后，采用MTT法检测细胞增殖活性，计算后得出转染USP22siRNA后HepG3B细胞的生长抑制率；10. USP22siRNA转染HepG3B细胞48h后，采用流式细胞术测定细胞凋亡率和细胞周期，比较沉默USP22基因后HepG3B细胞凋亡率和细胞周期的改变；11. USP22siRNA转染HepG3B细胞48h后，采用Western blot免疫印迹检测CyclinD1、CDK4和CDK6细胞周期蛋白表达水平。结果:免疫组化结果表明泛素水解酶22（USP22）在肝癌组织中的阳性表达率明显高于相应的癌旁组织和正常肝组织（p＜0.01）；RT-PCR结果表明泛素水解酶22（USP22）RNA在肝癌组织中的表达明显高于相应的癌旁组织和正常肝组织；采用ROC曲线分析用来确定USP22表达量的临界值(>3与≤3)。不论是在测试集中还是在整体病人中，单因素分析显示,临床TNM分期和Edmonson grade分级均与USP22基因表达的强弱有关(均P＜0.05)。多因素分析显示,当以USP22基因表达的强弱作为协变量进入Cox比例风险模型时,其为影响患者RFS和OS的独立危险因素(均P＜0.001)。多元分析显示,USP22的表达高低是HCC一个独立的预后参数。Western blot结果表明泛素水解酶22（USP22）蛋白在肝癌组织中的含量明显高于相应的癌旁组织和正常肝组织；RT-PCR及Western blot检测表明人肝癌细胞HepG2、HepG3B、Bel-7402中USP22的相对表达水平显著高于人正常肝细胞Chang live；用针对泛素水解酶22（USP22）基因的特异性siRNA干扰肝癌细胞HepG3B后，HepG3B细胞中USP22表达水平明显降低；MTT法检测其细胞生长抑制率为42.24%，明显高于对照组（tsiUSP22组=22.47，p＜0.01）；流式细胞仪检测其细胞凋亡率为33.08%±4.53%，明显高于对照组（tsiUSP22组=12.34，p＜0.01）；流式细胞仪检测细胞周期，发现其处于G1期细胞的百分比为68.81%±2.71%，明显高于对照组（tsiUSP22组=33.91，p＜0.01）；Western blot检测发现细胞周期蛋白CyclinD1、CDK4和CDK6在USP22siRNA组中的表达水平明显低于对照组（tCyclinD1=10.85，tCDK4=10.51，tCDK6=10.59，p＜0.01）。结论:泛素水解酶22（USP22）在肝癌组织中的表达明显高于相应的癌旁组织和正常肝组织；在人肝癌细胞HepG2、HepG3B、Bel-7402中USP22的表达明显高于人正常肝细胞Chang liver；USP22的表达高低是影响HCC患者预后的独立危险因素,其对HCC患者术后5年无复发生存率和总生存率的评估价值较高,为HCC患者的危险度分级及制订合理的治疗方案提供了参考意见；采用针对泛素水解酶22（USP22）基因的特异性siRNA序列转染HepG3B细胞后，可抑制肝癌HepG3B细胞增殖活性，可诱导其凋亡率升高，并导致细胞周期蛋白CyclinD1、CDK4和CDK6的表达水平下降，继而引起细胞G1期细胞周期阻滞。