脑胶质瘤作为神经系统最常见的恶性肿瘤,其恶性程度非常高,同时由于其高度侵袭性的特点,从而使得胶质瘤与周围正常脑组织无明显界限,接受手术切除后胶质瘤的复发率也非常高,而且再复发胶质瘤的恶性程度也会相应增加,从而导致目前胶质瘤临床治疗效果不甚理想。目前对胶质瘤的治疗尚未有特效的治疗方法,但得到国内外公认的治疗方案是尽可能完整切除肿瘤的同时保证患者生命安全和神经功能完整性,同时在术后配合化疗,但即便接受正规的内外科联合治疗,其5年存活率仍不超过5%。近年来,针对胶质瘤的手术方式、新的放疗手段及药物层出不穷,其中特别是替莫唑胺的出现对胶质瘤患者生活质量的改善和生存期的延长起到了不可替代的作用,但总体而言,目前的治疗手段并没有彻底改善高级别胶质瘤患者的预后。因此,脑胶质瘤仍旧是颅内肿瘤中最具挑战性和难度最高的疾病之一,也是神经外科领域研究的重点和热点,近年来,随着对胶质瘤基因分析研究的不断深入,针对胶质瘤的诸如免疫治疗和基因治疗等多种新型治疗方式不断涌现,有望更进一步改善胶质瘤患者预后。当前研究认为炎症反应和免疫调节紊乱在促进肿瘤发生和发展过程中扮演着不可或缺的角色,诸如白介素(IL)和肿瘤坏死因子(TNF)等促炎因子在许多实体肿瘤中表达升高。近年来,白介素-13(IL-13)由于与诸多恶性肿瘤和免疫疾病的密切联系而受到越来越多的关注;另外,IL-13在淋巴细胞、单核细胞和纤维母细胞的趋药性和迁移性中起到关键作用;同时,IL-13可调控多种恶性肿瘤细胞增殖、侵袭以及血管生长;在诸如结肠癌、宫颈癌、肺癌、胶质瘤和胰腺癌中IL-13均表达明显上调,与此同时,大多数正常细胞,如免疫细胞和上皮细胞中IL-13呈低表达或不表达;有研究表明IL-13可通过上调AP-1、ERK1/2以及MMP从而在促进宫颈癌细胞侵袭中发挥了重要作用;更有甚者,IL-13在信号转导和启动诸如PI3K、ERK/AP-1、Akt和Src等下游信号蛋白起到关键调控作用。以上研究均表明IL-13可作为对抗恶性肿瘤生长和转移的作用靶点。Tristetraprolin(TTP)作为串联锌指蛋白半胱氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-组氨酸(CCCH)级的成员,可在转录后水平调控许多促炎因子和生长因子,如IL-6、IL-33、NF-κB和HIF-α等。目前关于TTP作为一种mRNA破坏因子最明确的证据来自于对TTP敲除大鼠的观察,TNFαmRNA在这种大鼠的巨噬细胞中表达显著上调,从而导致血液循环中TNFα含量增加,进而引起全身炎症反应的多种症状;另外在TTP敲除小鼠中也观察到诸如恶液质、侵蚀性关节炎、皮肤炎、结膜炎和肾小球肾炎等多种炎症反应。当前对TTP作用机制的研究表明其可能通过与mRNA3’非翻译区保守的AU重复序列(AU-rich element,ARE)包埋mRNA的结合从而发挥对mRNA的破坏作用。在体外实验中,研究发现TTP与ARE片段最佳结合位点为包含AUUUA或AUUUUA的RNA序列。TTP不仅可调控炎症和免疫反应,TTP还参与了包括细胞分化、凋亡和癌变在内的许多病理生理反应过程。TTP可结合并破坏编码TNF-α,VEGF和c-MYC等多种致癌因子的mRNA,从而在调节恶性肿瘤细胞增殖和转移过程中也发挥了一定作用;一项最近的研究表明,TTP在多种恶性肿瘤和细胞系中表达下调,如结直肠癌、乳腺癌和胃癌等,但当前TTP是否与胶质瘤生长、转移和转归的关系尚未见系统性报道。本研究结果表明,TTP不仅在人胶质瘤组织和细胞株中均表达下调,同时TTP与胶质瘤患者预后相关;通过RNAi技术证明TTP可通过下调IL-13的表达从而抑制体外胶质瘤细胞生长、迁移和侵袭性行为;另外,TTP和IL-13在胶质瘤组织中呈明显负相关。总之,本次研究发现TTP可通过调控IL-13的表达从而与胶质瘤生长和运动能力密切相关,而TTP有望成为胶质瘤治疗新的作用靶点。本研究将从以下三部分进行讨论分析:1.TTP和IL-13在人脑胶质瘤及正常脑组织中的表达差异和相互关系目的:分析TTP和IL-13在人脑胶质瘤及正常脑组织中的表达,探讨TTP在不同级别胶质瘤患者中的表达差异,并进一步分析TTP和IL-13在胶质瘤组织中的相关性。方法:为了检测TTP和IL-13 mRNA在胶质瘤组织中的表达,我们收集了2011年6月至2012年6月期间在温州医科大学附属第一医院神经外科住院的50例脑胶质瘤患者的手术切除标本,所有手术标本均经两位副高职称的病理科专家确认为胶质瘤,对照组为同期在本院收治的11例颅脑外伤病人行减压手术切除的手术标本。50例患者标本均依据2007年世界卫生组织(World Health Organization,WHO)所制定的中枢神经系统肿瘤分类标准来进行病理诊断和分级,其中I级4例、II级17例、III级16例和IV级13例。所有纳入本次实验队列的胶质瘤患者采用qRT-PCR方法检测人脑胶质瘤组织中TTP和IL-13 mRNA的表达情况;分析TTP在低级别胶质瘤(I级和II级)和高级别胶质瘤(III级和IV级)中的表达差异;TTP和IL-13的相关性采用Spearman相关分析进行检验。结果:所有纳入本次队列的50例标本均经病理学医师确诊为胶质瘤,通过qRT-PCR法分析50例胶质瘤组织标本和11例正常脑组织标本中TTP和IL-13 mRNA含量,结果表明:TTP mRNA在胶质瘤组织中的表达较正常脑组织明显降低(t=-32.453,P<0.001);另外,与正常脑组织相比较,IL-13 mRNA在胶质瘤组织中的表达明显升高(t=53.182,P<0.001),差异均有统计学显著性;TTP在高级别胶质瘤标本中的表达较低级别胶质瘤标本明显减少,结果有统计学意义(χ~2=34.092,P<0.001);TTP和IL-13在胶质瘤组织中的表达呈负相关(R=0.576,P<0.001)。结论:(1)TTP和IL-13 mRNA在人脑胶质瘤组织中表达分别下调和上调,两者呈显著负相关。(2)TTP在高级别胶质瘤标本中的表达较低级别胶质瘤组织明显下调。2.TTP对体外人胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响目的:建立TTP过表达以及沉默TTP的胶质瘤细胞系,观察上调或下调TTP在胶质瘤细胞中的表达后对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:Western blot检验人胶质瘤细胞系SF295、SHG-44、U87和U251以及人正常星形胶质细胞系NHA中TTP蛋白的表达;分别构建TTP过表达和TTP沉默的慢病毒载体,并将其分别感染至胶质瘤细胞株U251和SF295,从而获得稳定过表达TTP基因的U251细胞和稳定沉默TTP基因的SF295细胞;利用CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭性行为。结果:(1)与NHA细胞相比较,TTP蛋白在SF295、SHG-44、U87和U251细胞中的表达均明显降低,由于TTP蛋白在SF295细胞中的表达较SHG-44、U87和U251细胞显著升高,而U251细胞中TTP的表达含量均低于SF295、SHG-44和U87细胞中的表达,因此U251和SF295细胞被选择进一步研究TTP在胶质瘤细胞中的作用。Western blot检测结果表明,感染TTP shRNA后SF295细胞中TTP蛋白表达量较感染前明显降低,差异有统计学意义;而同样转染TTP过表达慢病毒载体(TTP)至U251细胞后可明显上调TTP的表达。(2)细胞生物学功能性实验结果表明:在U251细胞中过表达TTP可抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭,而在SF295细胞中下调TTP的表达可促进其增殖、迁移和侵袭。结论:(1)能成功构建高效过表达以及沉默TTP基因的慢病毒表达载体。(2)过表达TTP可抑制体外胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭,而下调TTP的表达可促进体外胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭。3.IL-13及其下游因子在TTP抑制体外胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭中的作用目的:探讨IL-13及其下游因子在TTP抑制体外胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。方法:(1)CCK-8及Transwell小室实验检测IL-13单独及联合TTP对体外胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用;(2)Western blot检测IL-13/PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白在体外胶质瘤细胞中的表达。结果:(1)IL-13单独作用体外胶质瘤细胞后可促进细胞增殖、迁移和侵袭,同时削弱TTP对体外胶质瘤增殖、迁移和侵袭抑制作用;(2)感染TTP shRNA可明显上调IL-13蛋白和mRNA在体外SF295细胞中的表达,而感染TTP可显著抑制体外U251细胞中IL-13蛋白和mRNA的表达;(3)下调TTP在胶质瘤细胞中的表达可上调SF295细胞中p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的含量,而感染TTP后可抑制p-PI3K、p-Akt和p-mTOR在胶质瘤U251细胞中的表达。结论:体外实验结果表明IL-13/PI3K/Akt/mTOR通路在TTP抑制体外胶质瘤增殖、迁移和侵袭过程中发挥了一定作用。综上所述,本项研究结果表明:TTP和IL-13与人脑胶质瘤有一定联系,TTP在胶质瘤标本中的表达情况对评估胶质瘤患者的预后具有一定意义,从而在胶质瘤的诊断和预后评估方面具有一定的积极意义。应用RNAi技术上调TTP在胶质瘤细胞中的表达可有效抑制体外胶质瘤细胞生长和运动能力,下调TTP对胶质瘤细胞生长和运动能力有促进作用,IL-13/PI3K/Akt/mTOR通路可能在TTP调控体外胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭中发挥了一定作用,从而为胶质瘤的治疗及预后评估提供了新的思路和治疗靶点。