背景炎症性肠病（inflammatory bowel diseases,IBD）是一种非特异性的、累及胃肠道的自身免疫性疾病,包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）、克罗恩病（Crohn’s disease,CD）。IBD主要临床表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便,并伴随乏力、体重减轻、营养不良等症状,病程迁延、难以治愈,且有癌变风险,严重威胁着人类健康。目前认为,由于各种因素引起易感人群的肠道黏膜屏障被破坏、肠道菌群紊乱,致使机体免疫系统的耐受机制失灵,导致出现针对肠道的攻击反应,这种免疫失衡状态又进一步加重肠道菌群的紊乱,形成了持续的炎症反应,是IBD的主要发病机制。正常状态下,免疫系统的促炎因素和抑炎因素处于动态平衡状态,然而在IBD患者的免疫系统中,促炎力量过强而抑炎力量不足导致出现免疫系统紊乱,是推动疾病进展的关键。1型调节性T细胞（Type 1 regulatory T cells,Tr1细胞）是一种调节性CD4+T细胞,不同于为人所熟知的FOXP3+Treg细胞,它不表达核转录因子FOXP3,也没有其他特异性的标记分子。它以分泌大量IL-10、以IL-10依赖的方式抑制免疫反应为重要特征。尽管在外周血中所占比例很低,但由于其免疫调节功能很强大,在维持免疫平衡方面发挥重要作用。不仅如此,Tr1细胞是肠道IL-10的主要来源,除了可以分泌IL-10抑制炎症反应外,还能通过分泌IL-22维护肠黏膜上皮细胞的屏障功能,还可以诱导杯状细胞的分化,是胃肠道重要的免疫卫士。目前的临床数据发现,IBD患者的Tr1细胞存在数量不足或者功能缺陷;动物实验证实,输入外源性Tr1细胞可以改善小鼠结肠炎症状。然而,Tr1细胞具有同种异体抗原特异性,异体移植很难实现。因此,可以通过其他方式来诱导Tr1细胞,以纠正IBD失调的免疫状态。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是一种呈纤维细胞形状的贴壁细胞,具有三系分化能力,在特定的诱导条件下可定向分化为骨、脂肪和软骨组织。根据来源不同可有不同的名称,比如骨髓来源的MSCs、脂肪来源的MSCs、脐带来源的MSCs等。MSCs具有丰富的免疫调节功能,一方面可以抑制T细胞、B细胞、巨噬细胞、自然杀伤（Natural killer,NK）细胞、树突状细胞、中性粒细胞参与炎症反应;另一方面,可以诱导调节性免疫细胞,包括FOXP3+Treg细胞、调节性B细胞、IL-10分泌型树突状细胞、M2型巨噬细胞,增强免疫调节功能。相较于骨髓和脂肪来源的MSCs,脐带来源的MSCs易于获取,且增殖速度更快,免疫原性更低。因此,本课题中使用的是人脐带来源间充质干细胞（human umbilical cord derived MSCs,hUCMSCs）。MSCs对IBD的治疗已经显示了初步的治疗效果,但由于具体的作用机制不清晰,限制了临床的推广应用。我们设想MSCs在治疗IBD的过程中,Tr1细胞可能是其重要的靶细胞,MSCs可能是通过调控Tr1细胞来控制炎症进而减轻疾病的严重程度。方法我们收集健康足月儿脐带并从中分离出hUCMSCs,并通过形态学、流式细胞术鉴定细胞表面分子表达情况和定向分化能力三方面进行鉴定。在IBD动物模型上,我们采用2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS）对BALB/c小鼠灌肠的方式诱导急性小鼠结肠炎,腹腔注射hUCMSCs进行治疗,通过小鼠死亡情况、疾病活动度评分（Score for disease activity index,DAI评分）、体重变化、结肠缩短情况、宏观损伤评分（macroscopic score）、组织学评分（histological score）对结肠炎的严重程度进行综合评估。在筛选hUCMSCs最佳给药浓度的实验中,将小鼠随机分为5组,设立3个给药浓度,分别是5×10~5hUCMSCs/鼠、1×10~6hUCMSCs/鼠和2×10~6hUCMSCs/鼠,同时设立了对照组和TNBS造模组。第3天收取结肠组织、脾脏和肠系膜淋巴结,结肠组织行HE染色,并通过流式细胞术检测Tr1细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞。后续又应用最佳给药剂量的hUCMSCs治疗小鼠结肠炎,分别在第3天和第6天取材,检测hUCMSCs的作用持续时间。我们利用免疫磁珠法（Magnetic activated cell sorting,MACS）分选了CD4+T细胞和幼稚CD4+T细胞,采用IL10 capture assay法通过流式细胞术分选出Tr1细胞,Tr1细胞的画门策略为Aqua-CD4+CD44+IL10+。在探索hUCMSCs对Tr1细胞的调节机制上,首先建立了hUCMSCs与多种免疫细胞共培养的体系,在hUCMSCs-脾细胞共培养体系中,加入了COX-2/PGE2特异性阻断剂吲哚美辛、COX-2/PGE2非特异性阻断剂NS398,以及吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）阻断剂1-MT,检测了hUCMSCs对Tr1细胞的比例以及凋亡、增殖的影响。将hUCMSCs共培养过的Tr1细胞与小鼠脾细胞共培养,检测对T细胞增殖的抑制作用。在判定IDO在hUCMSCs调控Tr1细胞的作用时,我们通过si RNA技术将针对IDO的si RNA转染至hUCMSCs中,并通过q PCR和Western Blot验证敲低效果。将IDO敲低的hUCMSCs注射到结肠炎小鼠体内,验证IDO敲低的hUCMSCs对IBD的治疗作用和Tr1细胞的调控作用是否受影响。结果hUCMSCs为梭形、多角形呈贴壁性生长;通过流式细胞术检测了hUCMSCs的表面分子,CD29、CD44、CD73、CD90、CD105呈阳性表达,阳性率>98%,而CD34和CD45呈阴性表达,阳性率<1%;在特殊的培养条件下,hUCMSCs可被定向诱导分化成骨、软骨和脂肪组织。hUCMSCs对TNBS诱导的小鼠结肠炎有治疗作用,可明显改善小鼠的生存率、DAI评分、宏观损伤评分、组织学评分等指标,这种治疗作用呈剂量依赖性。hUCMSCs可上调Tr1细胞比例,而且Tr1细胞比例与小鼠结肠炎的组织学评分呈负相关,提示Tr1细胞可能是hUCMSCs的一种靶细胞。hUCMSCs可以上调小鼠Tr1细胞的比例,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,还能增强Tr1细胞的免疫抑制作用。加入IDO的抑制剂1-MT可以阻断hUCMSCs对脾细胞中Tr1细胞比例的上调作用。利用si RNA敲低IDO阻断了hUCMSCs对TNBS诱导的小鼠结肠炎的治疗作用,也抑制了对Tr1细胞比例的上调作用。结论hUCMSCs呈剂量依赖性治疗TNBS诱导的小鼠结肠炎,Tr1细胞的比例被上调,且与结肠炎的组织学评分呈负相关。Tr1细胞是hUCMSCs的一种靶细胞,hUCMSCs可以通过影响Tr1细胞的增殖和凋亡升高Tr1细胞的比例,并对Tr1细胞的免疫抑制功能有增强作用。hUCMSCs通过分泌IDO上调Tr1细胞来抑制炎症反应,进而控制结肠炎的症状。