单增李斯特菌是一种重要的人兽共患病原,同时也是最常见的食源性病原菌之一。致病性李斯特菌与其他食源性病原不同,主要引起中枢神经系统疾病并导致孕妇流产,具有较高的致病率与死亡率。随着国内的食源性病原菌监测系统不断发展完善,对于食源性疾病也越来越重视,但是我国缺乏单增李斯特菌的国家参考品,对于建立标准化诊断方法一直缺乏可靠依据。期间我国申报的多种单增李斯特菌体外诊断试剂盒申报缺少综合、客观、科学的评价标准,成为阻碍该行业发展的关键瓶颈。因此,完善单增李斯特菌的国家参考品成为行业发展的迫切需求。此外,由于李斯特菌能够在自然界环境中广泛存在,且对环境抗性较强的特点,但是对于李斯特菌属的其它菌种尚无系统的比较研究。因此本项目的一个科学问题:李斯特菌属优势菌种和/或血清型是否有更强的抗逆性?基于以上关键瓶颈和科学问题,本研究的目的是:1)收集具有明确背景来源的单增李斯特菌通过系统鉴别鉴定,制备单增李斯特菌国家参考品。2)研究6个常见李斯特菌种Listeria monocytogene,Listeria seeligeri,Listeria ivanovii,Listeria welshimeri,Listeria innocua,Listeria grayi的不同菌株在多种食品加工相关胁迫处理后存活率的比较分析。3)探索其在不同环境胁迫处理前后耐药性的变化规律。1.单增李斯特菌国家参考品的制备收集整理本实验室菌株库中不同来源的458株李斯特菌,其中包括单增李斯特菌临床分离株（n=13）、国际参考菌株（n=25）以及其它种的菌株（其他5个种型李斯特菌和食源性病原菌属大肠杆菌,链球菌）样品。通过多种不同方法（常规生化、分子生物学、质谱学）的鉴定和耐药性检测,结合全基因组测序对其生物学表型,基因型和耐药性等进行系统研究,确认单增李斯特菌的国家参考品。2.李斯特菌在不同环境胁迫下的比较分析通过模拟食品加工环境中常见的杀菌抑菌措施:热胁迫、酸碱胁迫、盐胁迫和紫外胁迫,选取单增李斯特菌（n=11,包括6种不同血清型）和非单增李斯特菌（n=10,包括5个常见种）,通过在摸索不同环境环境胁迫条件下,比较不同理化应激后细菌的存活率变化,进而评价其压力适应能力。结果显示李斯特菌对热胁迫较为敏感,21株细菌在65℃处理4min就开始出现死亡。pH值4-10的环境下,李斯特菌存活率并不会受到影响,而在环境达到极碱性（pH=12）与极酸性（pH=2）时,细菌存活率（N/N0）与处理时间呈正比。所有菌株都符合李斯特菌耐碱不耐酸的特性,在pH=12条件下,处理时间长达30 min,在实验室常规检测下均能检测到活菌生长。而在pH=2条件下处理10 min,就有8株菌无法被检测到生长。发现单增李斯特菌组抵抗强酸性胁迫的能力显著高于非单增李斯特菌。发现10%盐浓度可以有效遏制李斯特菌的生长。但是随着处理时间的延长,细菌的存活率下降趋势开始放缓,提示长时间盐胁迫可诱导李斯特菌的耐受现象。发现单增李斯特菌组抵抗盐胁迫的能力显著高于非单增李斯特菌。李斯特菌对紫外线均比较敏感,在21株菌中有1株在照射100 s即无法检测到活菌生长。单增与非单增李斯特菌两组间存活率没有显著差异。3.探索李斯特菌在不同环境胁迫处理后的耐药性变化规律李斯特菌在暴露于上述环境胁迫不同时间后,针对不同抗菌药物（n=8）的耐药性进行检测。其中最为明显的是:无论何种环境胁迫处理后细菌对于磺胺类药物复方新诺明的耐药性都有提升。在10%盐浓度下,能够长期存活的细菌对多种抗生素耐药性增强。不管是在酸胁迫还是碱胁迫环境,李斯特菌对上述抗生素的抗性增强与减弱情况完全相似。对于单增与非单增李斯特菌两组耐药性变化而言,除了盐胁迫环境较温和,长时间处理之外,其他环境胁迫为了减缓细菌大量死亡只处理很短的时间,且两组耐药性差异均不显著。在盐胁迫下,可观察到在这几种有变化的抗生素中,单增组的MIC值均显著强于非单增组。可见单增李斯特菌长期存活在盐胁迫下,诱导产生抗生素的耐药性比其它常见李斯特菌种更强。本研究与中国食品药品检定研究院合作研制信息完备的单增李斯特菌国家参考品,可用于体外诊断试剂的标准品。同时,本研究也通过模拟几种食品加工过程中的杀菌抑菌方法,分别评价对李斯特菌存活率和耐药性的影响,为食品加工中优化杀菌方法和遏制抗菌药物耐药性产生提供重要参考依据。