背景冠心病（coronary heart disease，CHD）的发病率在当今世界上占首要地位，该病一旦发展成心肌梗塞、心力衰竭，则病人生活质量下降，甚至丧失劳动力，给国家造成重大负担。非ST段抬高型心肌梗死（Non-STelevation myocardial infarction，NSTEMI)是CHD患者严重类型之一，常见于高龄、女性、高血压以及糖尿病患者。研究表明与药物保守治疗相比，经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）NSTEMI有利于降低患者的死亡率，改善NSTEMI患者的临床预后。但这些临床实验结论均是基于对NSTEMI患者要在适当的时机行PCI治疗，而不同的临床试验中，关于“适当的时机”的具体时间差异很大。因此，NSTEMI患者发病后何时采用PCI治疗才能使NSTEMI患者获得最大益处仍是一个尚待解决的问题。心肌缺血是CHD的发病重要的起因之一。近十年来，CHD的病理生理学有了长足的发展，多数学者认为冠状动脉硬化性心脏病是造成缺血性心脏病最常见的病因[1]。心肌缺血的基本矛盾是心肌细胞对氧的供需失调及心肌细胞代谢产物清除不良所致。然而心肌缺氧所致心肌损伤的发生机制尚未完全阐明[2]。近年来一些研究发现心肌细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）与心肌细胞缺氧损伤密切相关，因此ECM在CHD发生过程中起重要作用[3]，治疗CHD有效的药必须同时考虑到逆转左心室重构[2]。西洛他唑是一种磷酸二酯酶III型抑制剂，通过抑制磷酸二酯酶的活性抑制血小板聚集和扩张血管的效应。近年研究发现西洛他唑还可以抑制炎症因子诱导的核因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB)的激活，抑制血管细胞粘附分子-1（Vascular Cell Adhesion Molecule-1，VCAM-1）和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs），尤其是MMP-9的表达，改善氧化应激引起的内皮细胞（endothelial cells，ECs）衰老、TNF-a及超氧化物的形成。上述研究提示西洛他唑表现出不单具有抗血小板聚集作用的多效性，但西洛他唑是否影响NSTEMI患者的左心室重构及心功能尚无定论。多数心肌梗死（myocardial infarction，MI）是由于冠状动脉管腔内动脉粥样硬化（artherosclerosis，AS）斑块破裂导致急性血栓形成。斑块破裂后暴露的脂质核心中的巨噬细胞被激活，分泌组织因子，促使血小板在破裂处发生聚集，形成堵塞冠状动脉管腔的血栓。AS斑块主要由富含脂质的粥样物质与覆盖其上的纤维帽组成，纤维帽厚度在稳定AS斑块中发挥重要作用。易损斑块的破裂是引起MI的主要原因，而在AS斑块破裂时炎症参与了斑块的破裂过程，表现在外周血中的C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、纤维蛋白原和相关的致炎因子的浓度明显升高。在AS斑块失稳定的过程中，炎症可以激活单核源性的巨噬细胞合成和分泌MMPs，MMPs可以降解AS斑块中的ECM。越来越多的证据表明，MMPs在AS斑块失稳定的过程中起重要作用。左心室重构是AMI后常见的病理生理过程，左心室舒张末期容积（leftventricular end-diastolicvolume，LVEDV）和左心室射血分数（Left entricularejection fraction，LVEF）是反映左心室重构的重要指标。MMPs参与的胶原基质降解是AMI后左心室重构的重要机制。本课题将探讨对NSTEMI患者采用不同时机（早期或延迟）介入治疗以及是否合用西洛他唑对NSTEMI患者左心室重构及左心室功能的影响；同时研究NSTEMI患者血浆中MMP-2和MMP-9能否成为左心室重构及左心室功能障碍的预测因子；此外从细胞分子水平阐明西洛他唑对改善心肌缺氧所致心肌损伤的药理机制，为临床应用西洛他唑药物提供实验依据。目的1明确NSTEMI患者血浆中MMPs、组织金属蛋白酶抑制剂-1（tissueinhibitors of metalloproteinases，TIMP-1）及相关炎症因子浓度的变化，分析MMPs与部分炎症因子间关系；2探讨NSTEMI后MMPs时间变化规律及其对NSTEMI后左心室重构的预测效果；3研究NSTEMI的早期或延迟介入治疗和西洛他唑对左心室重构及左心功能的影响；4观察缺氧诱导后不同时期、不同程度心肌细胞凋亡时MMPs活性水平的动态变化；5探讨西洛他唑干预缺氧诱导培养的心肌细胞凋亡机制；方法1试验对象的选取：试验一连续入选NSTEMI、不稳定型心绞痛（unstable angina pectoris，UAP）和稳定型心绞痛（stable angina pectoris，SAP）患者各30名，分别于入院即刻抽取外周静脉血。另取30名健康成人血液标本做为对照组，酶联免疫吸附分析（enzyme linked immune sorbentassay，ELISA）检测血浆中MMP-1，MMP-2、MMP-9、TIMP-1、白介素-6（interieukin-6，IL-6）、高敏C-反应蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）和TNF-α的浓度。分析MMP-2、MMP-9、TIMP-1、IL-6与hs-CRP的相互关系。试验二连续入选符合入选标准，无排除条件并行PCI的NSTEMI患者74名，随机分为早期PCI组（发病24 h内完成PCI）及延迟PCI组（发病36 h后任何时间完成PCI）。两组患者根据是否给予西洛他唑治疗再次分为西洛他唑治疗组及非西洛他唑治疗组。PCI术前及术后即刻抽取血液，分析术前及术后血浆中MMP-2、MMP-9及hs-CRP的浓度变化。PCI术前常规给予氯吡格雷及阿司匹林，西洛他唑组给予西洛他唑100mg，2/日口服，连续应用6个月。2入选的NSTEMI患者PCI术后临床随访6个月，对比术前及术后6个月心脏超声图，分析各组LVEDV的变化和LVEF。研究NSTEMI介入治疗时机及西洛他唑治疗对左心室重构的影响。3各组NSTEMI患者分别于MI发病后2天、4天、7天、4周抽取外周静脉血，ELISA检测MMP-2、MMP-9的浓度。分析MMP-2和MMP-9在MI后的表达情况及不同处理方式对其浓度的影响。探讨不同时间点MMP-2、MMP-9浓度与LVEDV变化及LVEF的相关关系。4本实验以乳鼠心肌细胞作为研究对象，采用Annexin V/PI双染细胞检测方法测定凋亡心肌细胞,明胶酶谱分析检测细胞凋亡过程中MMP-2的活性变化，Western blot方法检测细胞凋亡过程中MMP-2、NF-κB和P53蛋白的表达，通过阻断抑制TNF-а和MMP-2实验，观察缺氧对心肌细胞凋亡的生物学效应，检测不同浓度西洛他唑对缺氧后不同时期的心肌细胞凋亡水平变化，并初步分析其变化的可能机制。5统计学处理采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，结果以-x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，处理组同对照组间的多重比较采用Dunnett法；两组间均数比较采用两独立样本t检验；两变量之间关系分析采用双变量相关分析；P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。结果1入选试验一的各组患者一般情况同对照组和SAP组相比，白细胞计数在UAP组和NSTEMI组的患者中显著性升高（P<0.01），但白细胞计数在UAP组和NSTEMI组无显著性差异(P>0.05)；各组在年龄、性别构成、吸烟、伴随疾病、血脂等方面，差异无显著性(P>0.05)。2 MMPs及部分炎症因子在NSTEMI中的表达与对照组和SAP组相比，MMP-1、MMP-2、MMP-9，TIMP-1，TNF-a，hs-CRP和IL-6浓度在UAP组和NSTEMI组患者血浆中升高并具有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。同UAP组相比，NSTEMI组患者血浆中MMP-1、-9，TIMP-1和TNF-a，Hs-CRP和IL-6浓度显著升高（P<0.05或P<0.01）。MMP-2的浓度在UAP组和NSTEMI组差异无显著性（P=0.077）。在NSTEMI患者中，发病时MMP-2，MMP-9，TIMP-1和IL-6的浓度改变与hs-CRP浓度改变明显相关（分别为r＝0.316，P=0.012；r＝0.862，P=0.000；r＝0.375，P=0.041和r＝0.583，P=0.001）。而其中MMP-9的浓度改变与hs-CRP的浓度改变相关性最强。3试验二入选患者一般情况及随访6个月主要不良事件发生率各组患者在年龄、性别构成、吸烟、伴随疾病、血脂、白细胞计数、入院前服用药物情况等方面，均无显著差异(P>0.05)。PCI术后随访6个月期间，各组在死亡率、因MI再入院率、心衰发生率等不良事件发生方面无显著差异(P>0.05)。4 PCI术对MMPs及hs-CRP的影响同术前相比，PCI术后MMP-2，MMP-9及hs-CRP的浓度在早期PCI组和延迟PCI组均显著性升高(P<0.05或P<0.01)。5 MI后MMP-2，-9的变化同MI后2天相比，各组MI后4天、7天、4周血浆中的MMP-2浓度显著性升高（P<0.01）。同MI后4天、7天相比，各组MI后4周血浆中的MMP-2浓度显著性升高（P<0.05或P<0.01）。MI后4周，西洛他唑治疗组较非西洛他唑治疗组显著性降低MMP-2的浓度（P值均<0.01）。同MI后2天相比，各组MI后4天血浆中的MMP-9浓度显著升高（P<0.01），MI后7天血浆中的MMP-9浓度显著降低（P<0.01）；MI后4周血浆中MMP-9的值较MI后7天的值显著降低（P<0.01）。MI后4天及1周时，早期介入治疗组MMP-9的浓度较延迟介入治疗组显著降低（P值均<0.05）；西洛他唑治疗组较非西洛他唑治疗组显著性降低MMP-9的值（P<0.05及P<0.01）。6随访6个月后各组ΔLVEDV和LVEF入选的患者PCI术后随访6个月，复查心脏超声，分别测量LVEDV和LVEF。LVEDV同患者6个月前的结果比较，计算LVEDV的变化量（ΔLVEDV）。结果显示，不同处理组间ΔLVEDV差异显著。同延迟介入治疗组相比较，早期介入治疗组ΔLVEDV显著性降低（P<0.05及P<0.01）；西洛他唑治疗组较非西洛他唑治疗组显著降低ΔLVEDV值（P值均<0.01）。LVEF在早期介入治疗组较延迟介入治疗组显著性升高（P值均<0.05）；西洛他唑治疗组LVEF的值较非西洛他唑治疗组显著性升高（P值均<0.05）。7入院即刻的MMP-2，-9的浓度与ΔLVEDV和LVEF的关系NSTEMI患者入院即刻的MMP-2的浓度与ΔLVEDV无明显相关性（r=0.096，P=0.454），但与LVEF呈明显的负相关（r=-0.420，P=0.001）；入院即刻的MMP-9浓度与ΔLVEDV呈明显正相关性（r=0.712，P=0.000），与LVEF具有明显的负相关性（r=-0.672，P=0.000）。8 MI后4天的MMP-9浓度与ΔLVEDV、LVEF的相关分析MI后4天各组的MMP-9值，与6个月后的ΔLVEDV呈明显正相关（r＝0.791，P=0.000；r＝0.667，P=0.003；r＝0.800，P=0.001和r＝0.653，P=0.006）；与6个月后的LVEF显著负相关（r＝-0.735，P=0.001；r＝-0.672，P=0.003；r＝-0.576，P=0.031和r＝-0.759，P=0.001）。9 MI后4周的MMP-2浓度与ΔLVEDV、LVEF的相关分析MI后4周，西洛他唑治疗组的MMP-2值与ΔLVEDV无明显相关性（r＝0.342，P=0.185和r＝0.472，P=0.088）；非西洛他唑治疗组后的MMP-2值与心梗6个月后的ΔLVEDV相关显著（r＝0.562，P=0.019和r＝0.581，P=0.018）。MI后4周的MMP-2的值，与同组MI后6个月的LVEF显著负相关（r＝-0.594，P=0.015；r＝-0.677，P=0.003；r＝-0.579，P=0.030和r＝-0.593，P=0.015）。10西洛他唑干预抑制缺氧诱导原代培养的心肌细胞凋亡经流式细胞分析检测发现，缺氧培养细胞72h后，正常培养的心肌细胞死亡数量明显增加，且大部分死亡细胞为Annexin V和PI双染色阳性的凋亡细胞；相反，给予不同浓度的西洛他唑干预组心肌细胞凋亡数目较未干预组则明显降低，这种降低与西洛他唑的干预浓度呈明显正性相关。经Western blot分析证实，原代心肌细胞中cleave-caspase-3的表达明显增加，其结果与流式细胞分析结果一致。11西洛他唑干预抑制缺氧诱导的心肌细胞炎症因子TNF-а分泌随着心肌细胞缺氧时间的延长，对照组心肌细胞中TNF-а的分泌明显增加，而西洛他唑给药组心肌细胞中TNF-а的表达则明显下降。12 TNF-а上调MMP-2表达参与心肌细胞凋亡应用Western blot和明胶酶谱分析均提示，在缺氧诱导体外培养的心肌细胞凋亡过程中MMP-2的表达及活性均明显增强；应用TNF-а中和抗体抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡后，MMP-2的活性也明显下降。13西洛他唑抑制MMP-2活化对抗缺氧诱导的心肌细胞凋亡在细胞培养上清中加入MMPs抑制剂后，流式细胞双染检测分析发现，缺氧诱导的心肌细胞凋亡现象受到明显抑制。14缺氧诱导的心肌细胞凋亡与NF-κB和P53基因的活性有关应用Western blot方法检测NF-κB和P53基因在缺氧前后心肌细胞中的表达情况，结果发现心肌细胞凋亡过程中NF-κB和P53基因的表达明显上调；同时，体外加入TNF-а和MMP-2抑制剂均能显著降低NF-κB和P53基因在心肌细胞中的表达。结论1 NSTEMI患者发病入院时外周血中MMP-1，-2、MMP-9、TIMP-1及部分炎症因子浓度明显升高，提示MMPs及炎症反应参与了斑块的失稳定性。2早期介入治疗可以改善NSTEMI患者的左心室重构进程和改善心脏功能。3 NSTEMI患者行PCI术并伍用西洛他唑后，有利于改善心心室重构及心脏功能，其部分机制可能与抑制MMP-2，MMP-9有关。4 MMP-9及MMP-2参与了NSTEMI后左心功能障碍的发生、发展过程。5 NSTEMI后4天的MMP-9可以作为短期内左心室重构及左心室功能改变的预测因子。NSTEMI后30天的MMP-2浓度可以作为左心室功能障碍的预测因子。6缺氧诱导体外培养的原代心肌细胞凋亡与TNF-а和MMP-2活化相关。7西洛他唑抑制心肌细胞炎性细胞因子的分泌及抑制MMP-2的活化,从而对抗细胞凋亡。