花药培养是指采集小孢子细胞发育到了一定阶段的花药,使其能在人工合成的培养基中存活生长,并且改变花粉发育途径,使其不形成配子体,而像全能细胞一样分裂、分化,由单个的小孢子细胞发育并且长成完整植株的技术。花药培养是人工单倍体育种的重要手段,因其可操作应强,诱导率高等优点被广泛应用于各植物育种方面的研究。苹果单倍体育种的主要手段也是花药培养,苹果花药培养首先得到胚状体,再诱导胚状体生成幼苗,幼苗经过培养长成单倍体的植株。而胚状体的获得作为完整的技术链中的第一步,也是最关键的一步。本研究的主要目的是从细胞水平探明苹果花药培养诱导形成胚状体的细胞学发育过程。首先对丹霞、嘎啦花药进行培养,并且采集培养过程中不同培养天数的花药,制作石蜡切片进行观察,对观察到的不同发育阶段的细胞数量进行统计和数据分析,最后对花药的胚状体和愈伤组织诱导率进行统计计算。得到的结果如下:1、苹果花药制片技术优化:在传统的制作石蜡切片的基础上对脱水梯度、时间和染色时间进行了改良,使其适用于苹果花药的细胞学观察。通过实验获得一套适合苹果花药的完整石蜡切片制片技术流程,即石蜡切片的脱水环节改为50%、60%、70%、85%、95%、100%的梯度乙醇,以保证脱水后的花药不会皱缩变形,保持饱满状态;染色采用埃里希氏苏木精染液染色15 min,以保证切片染色良好。2、苹果小孢子细胞发育过程观察:通过对石蜡切片进行细胞学观察,并且与合子胚发育过程相对比,了解到苹果花药培养胚状体发育的特点,即花粉胚性细胞发育时,其基细胞与顶细胞发育无先后之分。3、通过镜检,找到了苹果花粉细胞从单个细胞,到多细胞团,再到球形胚,心形胚的细胞发育过程,且两品种细胞发育过程相同。4、通过比较不同品种胚发生过程中细胞的状态,观察嘎啦与丹霞的花粉细胞发育状态,发现嘎啦在花药培养过程中分裂的细胞所占比例较少,而愈伤组织细胞很多,丹霞在花药培养过程中分裂的细胞所占比例较多,而愈伤组织细胞较少,并且在5 d-60 d的花药培养过程中,嘎啦的愈伤组织细胞分布与丹霞的分裂细胞分布相似,都是在15 d-17 d之间细胞分裂分化活跃。但因两个品种基因型不同,树体本身营养条件不同,故两者的细胞发育差异性需后期深入研究。5、通过对比不同培养天数下细胞状态,将胚状体发生过程中的所有细胞状态,即正常细胞,分裂细胞,愈伤组织细胞以及死亡的细胞,统计细胞数量进行数据分析发现:正常细胞在整个胚发生过程中所占比例平均,没有明显变化;培养5 d-17 d是细胞分裂的主要时期,15 d-17 d是细胞分裂最旺盛的时间段;丹霞品种愈伤组织细胞在30 d之后是其发育主要时期;嘎啦的愈伤组织细胞在5 d-15d是其发育旺盛时期;死亡细胞在15 d-17 d之间所占比例最小,这个时间段正好是细胞分裂的旺盛时期。6、通过对花药培养得到不同品种的胚状体和愈伤组织进行数量统计和诱导率的计算,得到结果:丹霞胚状体诱导率5.2%,愈伤组织诱导率3.69%,嘎啦胚状体诱导率1.37%,愈伤组织诱导率7.94%。