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目的:构建自噬相关基因Beclin1的进化保守区ECD(evolutionary conserved district,ECD)和链霉亲和素(streptavidin,SA)重组质粒,表达纯化SA-ECD融合蛋白;建立抗PSMA适配子介导的自噬分子ECD和促凋亡开关分子NuBCP-9-r8靶向系统并初步研究其对前列腺癌细胞的功能。方法:首先采用基因合成技术获取靶基因SA-ECD,为了给下一步蛋白表达做准备,对目的序列进行密码子优化,并且在其前面添加了起始密码子ATG和一个His标签,共1011bp;然后克隆至pUC57载体鉴定无误后,再将其定向插入原核表达载体pET30a,以NdeI和HindⅢ作为酶切位点进行引物设计用于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)及双酶切鉴定筛选阳性克隆,随后进行序列测定。测序分析正确后,将pET30a-SA-ECD转化至BL21作为表达菌株,以IPTG终浓度1mmol/l,15℃诱导16h,37℃诱导4h作为表达的摸索条件。获得的sa-ecd融合蛋白由镍亲和凝胶层析柱及westernblotting分别进行纯化与鉴定。细胞穿膜实验鉴定八聚精氨酸(r8)的穿膜效率;利用链霉亲和素-生物素间高效特异结合的特性将融合蛋白sa-ecd、生物素标记的抗psma适配子及nubcp-9-r8按一定比例偶联起来,构建抗psma适配子靶向的细胞自噬和促凋亡系统,并采用emsa检测sa-ecd与生物素标记的抗psma适配子及nubcp-9-r8间的结合力;采用cck-8(cellcountingkit-8)、流式细胞术(flowcytometry,fcm)、台盼蓝染色、细胞形态学分析、吖啶橙染色、westernblotting等方法初步验证其对前列腺癌细胞的自噬与凋亡的诱导作用。结果:双酶切及基因测序证实重组质粒pet30a-sa-ecd构建成功;sa-ecd融合蛋白(含his标签)经iptg诱导在大肠杆菌中得以表达,低温且延长时间更利于蛋白的表达,所以选择iptg终浓度1mmol/l,15℃诱导16h作为表达的优化条件进行大量诱导表达;但融合蛋白sa-ecd主要存在于包涵体中,可溶性不足10%;为此,我们放大表达系统,对培养上清中的sa-ecd蛋白进行镍亲和凝胶层析柱纯化及westernblotting鉴定,验证其大小约为38kd,与理论相一致。荧光显微镜下观察到,与fitc-nubcp-9相比,fitc-nubcp-9-r8的荧光强度明显增强,说明八聚精氨酸(r8)能高效的穿过细胞膜;emsa实验结果可见,与biotin-a10/nubcp-9-r8组相比,sa-ecd+biotin-a10/nubcp-9-r8组呈现明显滞后的条带,而bsa+biotin-a10/nubcp-9-r8组则没有明显变化,证明融合蛋白sa-ecd能有效结合生物素标记的抗psma适配子及nubcp-9-r8;成功构建抗psma适配子靶向的细胞自噬和促凋亡系统,cck-8法检测lncap细胞存活率,结果显示靶向系统组对细胞的杀伤效果与sa-ecd组及a10-nubcp-9-r8组相比差异具有显著性(p<0.01);流式细胞术显示浓度0-40μg/ml的靶向系统组引起lncap细胞总凋亡百分率分别为(4.6±1.53)%、(6.98±2.12)%、(16.60±2.48)%、(42.03±2.28)%及(70.66±1.95)%,除5μg/ml组外,与阴性对照组的细胞凋亡率相比,差异均有统计学意义(p<0.01);台盼蓝染色中与对照组相比,sa-ecd组中lncap、c4-2、pc-3及hela的细胞活力下降(p<0.05),a10-nubcp-9-r8组中上述四种细胞的细胞活力没有明显变化(p>0.05),而靶向系统组中lncap和c4-2的细胞活力显著降低(P<0.01),说明靶向系统对PSMA(+)前列腺癌细胞有显著的杀伤作用;形态学分析结果进一步从形态学方面证实上述结论;吖啶橙和Western blotting检测显示靶向系统在一定浓度范围内,既能诱导LNCaP细胞自噬又能促进其凋亡。结论:本研究成功构建pET30a-SA-ECD重组质粒并表达纯化出融合蛋白SA-ECD;构建的抗PSMA适配子靶向的细胞自噬和促凋亡系统显示其对PSMA(+)前列腺癌细胞有杀伤作用,为探索治疗前列腺癌的新途径奠定了基础。