【摘 要】
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研究NDRG2、NDRG4在肿瘤发生发育中所起的作用将有助于人们提高对多种肿瘤的认识水平,并可能对相关肿瘤的基因治疗找到新的思路和方案.本实验的思路是将NDRG2、NDRG4基因分别
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研究NDRG2、NDRG4在肿瘤发生发育中所起的作用将有助于人们提高对多种肿瘤的认识水平,并可能对相关肿瘤的基因治疗找到新的思路和方案.本实验的思路是将NDRG2、NDRG4基因分别进行克隆、表达、纯化并优化出合适的纯化方案,通过纯化出足量的蛋白以制备IgY抗体为下一步的研究提供检测手段,同时考察这两种蛋白对肿瘤细胞及肿瘤组织的生物学活性以期为下一步的基因功能研究提供思路.将NDRG2、NDRG4基因分别克隆进PQE30/M15表达载体,DNA测序证明构建正确.IPTG诱导表达<[1][2]>,SDS-PAGE证实表达蛋白分子量符合预期.通过正交实验考察合适的诱导表达条件,考察不同溶解液对洗涤后的NDRG2、NDRG4包涵体的溶解能力,分别采用分步透析和稀释方式考察合适的蛋白复溶条件<[3][4][5]>,采用脱盐柱脱盐后,分别采用5种阴离子交换树脂、亲和层析和分子筛考察纯化效果<[3][2]>,优化出合适的三级纯化方案,为下一步制备高纯度的蛋白以进行细胞活性研究及今后对蛋白的结构研究提供物质准备.测定纯化产物的等电点.蛋白N端测序证实表达蛋白N端氨基酸序列正确.使用纯化后的NDRG2、NDRG4蛋白超免疫鸡获得鸡卵黄IgY抗体,用硫酸铵沉淀法纯化该抗体,交叉滴定确定合适的包被抗原浓度和二抗浓度后ELISA测定抗体滴度,免疫印迹检测制备出的抗体呈阳性.在考察NDRG2、NDRG4蛋白对肿瘤细胞及肿瘤组织的生物学活性部分,通过设置不同浓度的蛋白剂量并设置不同对照组,测定NDRG2、NDRG4蛋白对7901、HHCC细胞的抑制效果<[6]>;通过裸鼠抑瘤实验考察NDRG2、NDRG4蛋白对肿瘤组织的抑制作用<[6][7]>,实验证实NDRG2、NDRG4蛋白对肿瘤细胞和组织均有较强的抑制作用,其中NDRG2蛋白明显强于NDRG4蛋白.
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