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衰老是机体随年龄改变而发生的所有现象的集中体现。在衰老过程中,机体各组织器官的功能逐渐降低,最终导致机体死亡。因此,可以把衰老定义为机体对内、外环境改变的、年龄依赖性的易损性增加。大量的研究表明,衰老是导致冠心病的主要独立危险因子。衰老的心脏心功能下降、对缺血/再灌注损伤敏感性高、梗死面积大、溶栓治疗和预后处理对老年心梗病人的收效也远不如对青年人,提示老年心脏对心肌缺血等疾病易感性增加,但其机制一直处于探索之中。近年的研究表明,人类和动物衰老过程中出现大量心肌细胞丢失；从17岁到90岁,单纯由于年龄因素,人体心肌细胞减少约1/3：在70岁健康男性中,仅由衰老导致的心肌细胞丢失就占左、右心室细胞总数的30％。由于心肌细胞是心脏功能活动的基本单位,这种随年龄增长发生的心肌细胞进行性丢失可能是衰老心脏心功能下降和对疾病易感性增加的重要因素。目前,全球人口老龄化趋势增高,心血管疾病的发病率和死亡率都将继续增长。因此,努力揭示与年龄相关的心肌细胞死亡机制,进而寻求更有效的防治措施是当今亟待解决的重大科学问题。
一、衰老对心脏中HtrA2/Omi表达影响及与心肌细胞凋亡的关系
目的：
1、验证衰老心脏心功能改变以及心肌细胞凋亡程度；
2、观察衰老心肌组织中XIAP、HtrA2/Omi及Smac/DIABLO内源性线粒体后凋亡调节蛋白的表达,及其与心肌细胞凋亡的关系。
方法：
(1)分别选取雄性成年SD大鼠(4-6月,n=39)(其中测定心功能死2只,呼吸道感染1只)和老年SD大鼠(22-24月,n=63)(其中测定心功能死7只,排除患肿瘤2只,呼吸道感染6只),随机分为以下4组：
①正常成年组(n=36)：经右侧颈总动脉插管进入大鼠左心室,监测心功能,不结扎冠状动脉：
②正常老年组(n=36)：经右侧颈总动脉插管进入大鼠左心室,监测心功能,不结扎冠状动脉；
③老年ucf-101组(n=6)：腹腔注射ucf-101(1.5μmol/kg)3小时后,经右侧颈总动脉插管进入大鼠左心室,监测心功能,不结扎冠状动脉；
④老年DMSO组(n=6)：腹腔注射DMSO(1.5μmol/kg)3小时后,经右侧颈总动脉插管进入大鼠左心室,监测心功能,不结扎冠状动脉。
(2)经右侧颈总动脉插管进入左心室,监测心率、左心室压力、左心室压力变化最大速率和心肌收缩指数(Cardiac Index,CI)等心功能指标；
(3)分别采用原位末端标记法(TUNEL)和Caspase-3活性测定法检测大鼠心肌组织中心肌细胞凋亡发生情况；
(4)用Western-blot法检测大鼠心肌组织中XIAP、HtrA2/Omi、Smac/DIABLO蛋白水平的表达水平；
(5)用Real-Time PCR法检测大鼠心肌组织中XIAP、HtrA2/Omi、Smac/DIABLO基因水平的表达水平。
小结：
1.衰老大鼠心肌细胞凋亡增加、心功能明显降低；
2.衰老大鼠心肌组织中HtrA2/Omi表达明显增高,XIAP表达明显下降,Smac/DIABLO表达不变。提示在衰老大鼠心肌组织中表达增多的HtrA2/Omi,可能导致了XIAP的降解以及随后的Caspases活化和细胞凋亡；
3.在衰老大鼠中,给予特异性HtrA2/Omi的抑制剂可显著减少心肌细胞凋亡,提示HtrA2/Omi在衰老心肌细胞凋亡中可能具有比较重要的作用。由于HtrA2/Omi是目前认为较强的线粒体后促凋亡蛋白,因此特异性抑制HtrA2/Omi表达或阻断其从线粒体的释放,可能成为抑制衰老心脏细胞凋亡的新靶点。
二、衰老心肌缺血/再灌注易感性增高可能与HtrA2/Omi的高表达有关
目的:
1、验证衰老心脏对缺血/再灌注损伤的易感性增加；
2、观察衰老心脏缺血/再灌注后心肌细胞中HtrA2/Omi是否由线粒体释放入胞浆,并探讨衰老的心脏与缺血/再灌注损伤易感性增加的机制。
方法:
(1)分别选取雄性成年SD大鼠(4-6月,n=38)(其中测定心功能死3只,呼吸道感染5只)和老年SD大鼠(22-24月,n=54)(其中测定心功能死4只,自发性肿瘤1只,呼吸道感染7只),随机分为6组：
①成年伪手术组(成年Sham组n=6)：经右侧颈总动脉插管进入大鼠左心室,监测心功能,不结扎冠状动脉；
②老年伪手术组(老年Sham组n=6)：经右侧颈总动脉插管进入大鼠左心室,监测心功能,不结扎冠状动脉；
③成年缺血/再灌注组(成年MI/R组n=24)：左冠状动脉前降支缺血30分钟,再灌注3小时；
④老年缺血/再灌注组(老年MI/R组n=24)：左冠状动脉前降支缺血30分钟,再灌注3小时;
⑤老年缺血/再灌注+ucf-101组(老年MI/R+ucf-101组n=6)：左冠状动脉前降支缺血30分钟,再灌注3小时,再灌注前10分钟腹腔注射ucf-101(1.5μmol/kg);
⑥老年缺血/再灌注+Vehicle组(老年MFR+DMSO组n=6)：左冠状动脉前降支缺血30分钟,再灌注3小时,再灌注前10分钟腹腔注射DMSO(1.5μmol/kg)。
(2)六组实验动物分别经右侧颈总动脉插管进入左心室,监测心率、左心室压力、左心室压力变化最大速率和心肌收缩指数(Cardiac Index,CI)等心功能指标；
(3)分别采用原位末端标记法(TUNEL)和Caspase-3活性测定法测定心肌组织中心肌细胞凋亡发生情况；
(4)采用Evanse blue和TTC复染法检测心肌缺血/再灌注后大鼠心肌梗死面积；
(5)分别提取心肌组织中线粒体及胞浆成分,用Westem-blot法检测其中HtrA2/Omi、XIAP蛋白水平的表达。
小结:
1.衰老使大鼠心肌对缺血/再灌注损伤易感性增加；
2.衰老大鼠心肌缺血/再灌注后线粒体释放HtrA2/Omi增多,XIAP含量减少。给予ucf-101能够显著抑制这种改变,改善心肌细胞损伤,保护心功能。从某种程度上提示,这可能是衰老对缺血/再灌注损伤易感性增加的原因之一。