β-甘露聚糖酶高产菌株选育及其酶的纯化研究

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本研究以四川南充魔芋基地的土壤样品为实验材料,通过富集培养和分离纯化,筛选出80株产β-甘露聚糖酶的菌株。采用刚果红透明圈法进行初筛,得到10株酶活较高的菌株。将筛得的菌株摇瓶发酵后,用DNS法测定粗酶液酶活,选出一株酶活最高的菌株,其编号为MM5,酶活达到1594U/mL。通过形态观察、生理生化试验及16SrDNA序列分析监定该菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。以MM5为出发菌株,通过连续两次紫外诱变得到诱变菌株LD24H4,酶活提高到3717U/mL。通过单因素试验和正交试验确定了菌株LD24H4产酶的最佳培养基组分(g/L):魔芋20.0,干酪素2.5, NaCl 1.0, MgSO4 0.5, KH2PO4 0.5, pH 7.5。最适产酶培养条件:47℃,装液量90mL(250 mL三角瓶),接种量1%,转速200r/min。在此条件下发酵26h,β-甘露聚糖酶活为12534U/mL,达到优前的3.37倍。采用硫酸铰盐析、DEAE-sepharose FF离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤的纯化技术,对枯草芽孢杆菌LD24H4所产β-甘露聚糖酶进行纯化,所得酶液在SDS-PAGE电泳图谱中量单翼蛋白质区带。经计算该酶分子量为32kDa,最终回收率2.9%,纯化倍数3.47。对菌株LD24H4所产β-甘露聚糖酶的酶学性质进行初步研究。结果表明,酶的最适反应温度为50℃,40℃下酶活稳定:最适pH值为7.0,pH 5.4~7.4保持大部分酶活;Co2+,Cu2+对酶有激活作用,Mn2+,K+,Mg2+,Na+,Li+,NH4+,Fe3+,Hg+,Ca2+对酶有不同程度的抑制作用,面Zn2+和Ba2+对酶的影响不大:以魔芋粉为底物,测得该酶Km值和Vm值分别为0.05mg/mL和50000/μmol/(min·L),以槐豆胶为底物,Km值和Vm值分别为0.4mg/mL和50000μmol/(min·L)。
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