论文部分内容阅读
运动性肌肉疲劳（Exercise-induced muscle fatigue）特指运动引起肌肉产生最大随意收缩力量或输出功率暂时性下降的生理现象，它严重影响运动能力的发挥和体能的恢复，是运动医学领域研究的热点问题。其发生机制极其复杂，涉及中枢运动驱动、神经肌肉接头兴奋一收缩耦联和肌肉能量代谢等多种生理过程，其中肌肉基本化学物质的改变是肌肉收缩速度与强度改变的基础，绝大部分中枢神经系统和神经肌肉接头并没有累及。近来研究发现，骨骼肌碳酸酐酶Ⅲ（CarbonicanhydraseⅢ，CAⅢ）表达水平和／或活性的改变可能与骨骼肌疲劳的发生有关。然而有关肌肉疲劳发生后骨骼肌CAⅢ的表达情况研究尚未见文献报道，此外，如何在体外大量获取纯化的CAⅢ，然后将其转导进入骨骼肌以观察其对肌肉疲劳的影响呢?为解决以上问题，本研究通过大强度跑台运动和低频电刺激的方法建立了大鼠骨骼肌疲劳模型，探讨了骨骼肌CAⅢ水平与肌肉疲劳之间的关系；构建了含有编码TAT-CAⅢ全长DNA序列的质粒表达载体并表达纯化出融合蛋白，观察了TAT-CAⅢ在体内外的跨膜转运能力并通过补充TAT-CAⅢ初步观察了其对肌肉疲劳恢复的影响。本研究分以下三个部分：第一部分大鼠骨骼肌疲劳模型的建立及疲劳后肌肉和血清CAⅢ的表达情况目的构建大鼠骨骼肌疲劳模型并观察疲劳后肌肉和血清CAⅢ的表达情况，探讨CAⅢ与骨骼肌疲劳之间的关系。方法36只雄性SD大鼠随机分为对照组、运动组和刺激组。运动组参照Bedford方案进行一次大强度跑台运动制作大鼠急性疲劳模型，刺激组采用低频电刺激的方法诱发大鼠腓肠肌疲劳。Western blot检测大鼠骨骼肌及血清中CAⅢ的表达水平。结果（1）与对照组相比，运动组大鼠比目鱼肌CAⅢ的表达水平明显降低（P＜0．05），但趾长伸肌及血清CAⅢ的表达水平与对照组相比差异无统计学意义（P＞0．05）。（2）随刺激时间的延长，大鼠腓肠肌的肌力峰一峰（P-P）值及肌力微分值逐渐降低，与刺激开始时相比，刺激10min即有非常显著的差异（P＜0．01）；而疲劳指数（FI）则随刺激时间的延长逐渐增加，刺激40 min时FI高达52．14％左右。（3）肌电振幅P-P值及EMG时频指标IEMG、MPF和MF值均随刺激时间的延长而逐渐降低。与刺激开始时相比，刺激5min时MPF的变化已有显著的差异（P＜0．05），而肌电振幅P-P值及IEMG值在刺激10min时方有显著的差异（P＜0．05）；MF值尽管随刺激时间的延长有所降低，但各时间点差异无统计学意义（P＞0．05）。（4）与对照组相比，刺激组大鼠腓肠肌CAⅢ的表达水平明显降低（P＜0．05），而比目鱼肌及趾长伸肌CAⅢ的表达水平虽均有下降但差异无统计学意义（P＞0．05）。结论（1）低频电刺激致骨骼肌疲劳后的肌电信号变化与运动性疲劳时sEMG信号变化相似，具有一定的特征，表明大鼠腓肠肌疲劳模型建立成功；（2）急性大强度跑台运动及低频电刺激诱发肌肉疲劳后均可引起相应骨骼肌CAⅢ的表达下调（前者表现为比目鱼肌，后者为腓肠肌），表明骨骼肌疲劳的发生可能与其CAⅢ的表达下调有关。第二部分TAT-CAⅢ融合蛋白的表达、纯化及其跨膜转运功能的鉴定目的构建含有编码CAⅢ和TAT-CAⅢ全长DNA序列的质粒表达载体，并进行诱导表达和纯化，在体内外鉴定TAT-CAⅢ的跨膜转运能力。方法（1）采用PCR的方法扩增编码CAⅢ和TAT-CAⅢ全长的DNA序列，分别重组入pET28a质粒表达载体中，测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21（DE3），构建重组体的表达菌株；IPTG诱导后，用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化融合蛋白，纯化产物进行SDS-PAGE分析、Western blot鉴定及磷酸酶活性染色；（2）分别以1μmol／L纯化的CAⅢ及TAT-CAⅢ孵育C2C12成肌细胞和PC12细胞1h，间接免疫荧光法检测两者在细胞内的分布情况；然后分别用含0．1、0．5、1．0、2．0μmol／LTAT-CAⅢ的无血清培养基孵育C2C12成肌细胞1h和用含1μmol／LTAT-CAⅢ的无血清培养基孵育细胞15、30、60、120min，间接免疫荧光染色和Hoechst 33342染色观察TAT-CAⅢ细胞转导率与其浓度和孵育时间之间的关系；（3）分别经腓肠肌肌膜外注射200μ1 0．25mg/ml的TAT-CAⅢ和CAⅢ，注射后30min、60min、90min取材，间接免疫荧光法检测TAT-CAⅢ融合蛋白对骨骼肌的穿透作用。结果（1）成功地构建了含有及不含有TAT的CAⅢ质粒表达载体；转化大肠埃希菌BL21（DE3）后表达并纯化出相对分子量分别约32 000（CAⅢ）和35 000（TAT-CAⅢ）的融合蛋白，Western blot和酶活性染色鉴定表明成功地获得了两种融合蛋白。（2）分别以一定浓度的融合蛋白孵育C2C12成肌细胞和PC12细胞1h后，TAT-CAⅢ组细胞内可见有较强的绿色荧光，而CAⅢ组细胞内则未见荧光。进一步分析发现，细胞荧光强度随TAT-CAⅢ孵育浓度的增加和孵育时间的延长而逐渐增强且各组细胞转导率均达100％。（3）腓肠肌肌膜外注射TAT-CAⅢ后，荧光显微镜下观察发现骨骼肌中出现大量红色荧光染色阳性的细胞，其中注射60min后荧光强度最高；而阴性对照组和CAⅢ注射组除胞膜上有少许非特异性着色外未见有荧光染色阳性细胞。结论成功地构建了含有及不含有TAT的CAⅢ质粒表达载体并表达、纯化出融合蛋白；间接免疫荧光染色显示TAT可介导CAⅢ由胞外跨膜转导进入胞内，且转导具有非选择性、效率高和作用迅速的特点。第三部分TAT-CAⅢ对缺氧复氧诱导的细胞凋亡的影响及其抗疲劳作用的初步观察目的观察TAT-CAⅢ对缺氧复氧诱导的细胞凋亡和疲劳恢复过程中腓肠肌肌力的影响，初步探讨其在疲劳消除中的作用。方法（1）流式细胞仪检测TAT-CAⅢ对缺氧复氧诱导的C2C12细胞凋亡的影响；（2）将重组质粒pET28a-TAT-CAⅢ转化表达菌Ecoli．BL21（DE3）后，采用低温诱导的方法表达和纯化可溶性融合蛋白TAT-CAⅢ并进行鉴定；（3）电刺激至腓肠肌疲劳后，于肌膜外补充TAT-CAⅢ，观察其对疲劳恢复过程中腓肠肌肌力的影响。结果（1）与OGD组相比，细胞经CAⅢ预处理后行OGD再复糖复氧时细胞凋亡率虽略有降低，但差异无统计学意义（P＞0．05），而不同浓度TAT-CAⅢ预处理组细胞凋亡率与OGD组相比则有非常显著的差异（P＜0．001）且细胞凋亡率随蛋白孵育浓度的增加而逐渐降低；此外，不同浓度TAT-CAⅢ组与CAⅢ相比亦有非常显著的差异（P＜0．01）。（2）通过低温诱导的方法获得了可溶性的融合蛋白，在非变性条件下对其进行分离纯化，透析浓缩后测定蛋白浓度达1．1mg/ml。（3）电刺激致大鼠腓肠肌疲劳后随恢复时间的延长，腓肠肌肌力逐渐回升，至刺激结束45min时，补充0．2mgTAT-CAⅢ组大鼠腓肠肌肌力与对照组和生理盐水组相比差异均有显著性（P＜0．05）；60min时，补充0．1mg和0．2mgTAT-CAⅢ组大鼠腓肠肌肌力均已接近正常水平，明显高于对照组和生理盐水组（P＜0．05），而补充CAⅢ组大鼠各时间点腓肠肌肌力水平虽高于对照组和生理盐水组，但差异无统计学意义（P＞0．05）。结论TAT-CAⅢ预处理可明显减少缺氧复氧诱导的C2C12细胞凋亡，表明转导入细胞的TAT-CAⅢ仍保持了其固有的生理功能；此外，通过低温诱导的方法获得了较高浓度的可溶性融合蛋白TAT-CAⅢ，初步观察到它具有一定程度消除疲劳的作用，这为消除肌肉疲劳提供了新的方法和思路。