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胃肠黏膜损伤是脾虚证常见病变之一,益气健脾中药对脾虚证患者胃肠道病变有改善作用。益气健脾中药可通过作用于多胺促进胃肠黏膜损伤修复。课题组前期发现,四君子汤、党参、黄芪、甘草的提取物(多糖、黄酮等)能促进小肠上皮细胞(IEC-6)迁移,机制与其影响细胞迁移多胺信号通路有关;黄芪70%醇洗脱部位(总皂苷含量>50a-%)能促进IEC-6细胞增殖。上皮细胞增殖、迁移、分化、粘附连接等是胃肠黏膜损伤修复的重要环节,也是益气健脾中药胃肠黏膜保护作用机制之一。研究目的观察黄芪总皂苷、人参总皂苷对小肠上皮细胞(IEC-6)增殖及其调节蛋白、细胞周期、细胞迁移和黏附连接蛋白的影响,并观察黄芪水提物、人参水提物对吲哚美辛致大鼠小肠黏膜损伤的影响,为探讨益气健脾中药黄芪和人参胃肠黏膜损伤修复作用提供参考。研究方法1.黄芪、人参总皂苷受试药的提取:黄芪和人参饮片分别经加热回流提取,正丁醇萃取,正丁醇部位过D101大孔树脂;黄芪正丁醇部位收集50%和70%乙醇洗脱液冷冻干燥得黄芪总皂苷;人参正丁醇部位收集80%乙醇洗脱部位冷冻干燥得人参总皂苷。蒸发光高效液相法(ELSD-HPLC)分析黄芪、人参总皂苷提取物的主要成分。2.黄芪、人参总皂苷在IEC-6细胞的实验方法:MTT法检测细胞增殖(含血清饥饿过程);流式细胞仪检测细胞周期;移液器吸头划痕法检测细胞迁移;Western blot法检测细胞增殖调节蛋白CDK2、RhoA、c-Myc和黏附连接蛋白(E-cadherin、α-catenin、β-catenin)表达。3.黄芪、人参水提物对大鼠小肠黏膜损伤的影响:吲哚美辛6mg.kg-1·d-1皮下注射4d造模,每天灌胃黄芪水提物(5g·kg-1、15g·kg-1)或人参水提物(5g·kg-1、15g·kg-1,实验剂量按生药量计)共7d给药,8d处死动物,取小肠黏膜,记录小肠黏膜损伤大体评分,HE染色进行病理评分。研究结果1.黄芪、人参总皂苷受试药检测:黄芪总皂苷得率1.32%,皂苷含量88.8%;人参总皂苷得率2.12%,皂苷含量92.2%。黄芪总皂苷主要成分为黄芪甲苷;人参总皂苷检测到3个主要成分为人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1。2.黄芪、人参总皂苷对细胞增殖的影响:黄芪、人参总皂苷(50 mg·L-1或100mg·L-1或200 mg·L-1,下同)给药48h能促进细胞增殖,也能逆转DFMO(多胺合成抑制剂)对细胞增殖的抑制。提示其有促进细胞增殖的作用。3.黄芪、人参总皂苷对细胞周期的影响:黄芪、人参总皂苷给药后与空白组比较,G0/G1期百分比下降,G2/M+S期百分比上升;能逆转DFMO所致G0/G1百分比上升、G2/M+S期百分比下降;提示其可促进细胞从静息状态进入细胞分裂状态。4.黄芪、人参总皂苷对细胞增殖调节蛋白表达的影响:黄芪、人参总皂苷能提高细胞c-Myc(转录因子)、RhoA(RhoGTP酶)和Cdk2(细胞周期依赖激酶)蛋白表达,逆转DFMO对c-Myc、RhoA、Cdk2蛋白表达的抑制;提示其促进细胞增殖与提高增殖调节蛋白表达有关。5.黄芪、人参总皂苷对细胞迁移的影响:受试药对细胞迁移无明显影响。6.黄芪、人参总皂苷对c-Myc、E-cadherin、α-catenin和β-catenin表达的影响:在划痕损伤细胞迁移模型观察3种培养条件下受试药对相关蛋白表达的影响。①正常含钙培养时:黄芪、人参总皂苷能提高转录因子c-Myc蛋白表达;黄芪总皂苷能提高粘附连接蛋白E-cadherin表达,但对α-catenin和β-catenin蛋白表达无明显影响;人参总皂苷能提高E-cadherin和α-catenin蛋白表达,而对β-catenin蛋白表达无明显影响。②无钙培养时(培养液不含Ca2+):黄芪、人参总皂苷能提高转录因子c-Myc蛋白表达;无钙培养可致黏附连接蛋白E-cadherin和α-catenin表达下降,而黄芪、人参总皂苷对E-cadherin、α-catenin和β-catenin蛋白表达均无明显影响。③含钙培养+DFMO负荷时:DFMO负荷能降低c-Myc、E-cadherin和α-cetenin蛋白表达,但对β-catenin蛋白表达无明显影响;黄芪、人参总皂苷能逆转DFMO对c-Myc和E-cadherin蛋白表达的抑制,但对α-catenin、β-catenin蛋白表达无明显影响。黄芪、人参总皂苷在3种培养条件下均能提高转录因子c-Myc蛋白表达,表明对c-Myc的影响是其重要作用效应之一,为进一步从调节c-Myc角度探讨黄芪、人参总皂苷不同药理作用提供了参考;但其对黏附连接蛋白表达的影响较弱。7.黄芪、人参水提物对吲哚美辛致大鼠小肠黏膜损伤的影响:黄芪水提物(15g·kg-1)和人参水提物(5g·kg-1、15g·kg-1)对造模大鼠小肠黏膜损伤有防治作用,大体和病理评分与模型组比较均P<0.05;黄芪水提物(15g·kg-1)还能降低造模大鼠死亡率(与模型组比较P<0.05)。提示黄芪、人参有防治小肠黏膜损伤的作用,也为后续以黄芪、人参总皂苷为受试药在动物水平观察药效打下基础。研究结论黄芪、人参总皂苷能促进IEC-6细胞增殖,作用机制与其影响细胞周期、提高增殖调节蛋白c-Myc、RhoA和Cdk2表达有关;其在细胞迁移模型也能提高c-Myc蛋白表达,表明对转录因子c-Myc的影响可能是黄芪、人参总皂苷调节细胞不同效应的共同作用点之一;黄芪、人参总皂苷促进细胞迁移的作用相对较弱,且在该模型上提高黏附连接蛋白表达的作用也较弱;黄芪、人参水提物对吲哚美辛致大鼠小肠黏膜损伤有防治作用。本研究为从不同角度探讨益气健脾中药黄芪、人参胃肠黏膜损伤修复作用提供了参考。