稻曲病(Rice false smut)是一种发生在水稻穗部的真菌病害,其病原为稻绿核菌(无性态学名:Ustilaginoidea virens Takahashi;有性态学名:Villosicla vavirens Tanaka and Tanaka),产生的真菌毒素严重影响水稻的生长并对人畜产生毒害,造成水稻减产并影响稻米的食用安全,稻曲病已成为水稻生产上的一种主要病害。稻曲病在后期形成的红黄色或黑色稻曲球是该病为害的主要病征,其产生的次生代谢物主要为稻曲菌素(Ustiloxins)和稻绿核菌素(Ustilaginoidins),稻绿核菌素是一类具有萘并-γ-吡喃酮二聚体结构特征和多种生物活性的真菌毒素,而稻曲菌素为环肽类真菌毒素。鉴于稻曲球中尚有多个稻绿核菌素未被鉴定,以及稻绿核菌素的潜在开发与应用价值,本研究以稻曲球为原材料,采用各种技术手段对其中的稻绿核菌素类化合物进行分离和鉴定,并对该类型化合物的制备工艺、富集工艺以及指纹图谱的分析方法进行研究,主要结果如下。(1)采用硅胶柱层析、凝胶柱层析和高速逆流色谱等方法对稻曲球乙酸乙酯层粗提物进行分离纯化,得到25个单体化合物,通过紫外(UV)、红外(IR)、高分辨电喷雾质谱(HRESIMS)、一维和二维核磁共振(1H、13CNMR、HSQC、HMBC)波谱、圆二色谱(CD)等方法鉴定了化合物的结构,均为稻绿核菌素化合物,其中Ustilaginoidins A、B、C、D、E、F、G、H、I、J为同来源已报道的化合物,Ustilaginoidins K、L、M、N、P、E1以及IsochaetochrominB,为首次从稻曲球中分离出的化合物,Bl-2、B4、B4-2、B3-1、B5-1、B5-2、C1、C4为本研究首次报道的新稻绿核菌素,在C-9,9’位均具有R的轴手性构型。新化合物B4、C4具有特殊的2-羟丙基取代基团,B3-I具有特殊的甲酸酯取代基团。(2)评价了具有羟甲基取代基团的Ustilaginoidins B、C、H、I、J以及新化合物B1-2、B5-2、C4、C1、B3-1的植物毒和细胞毒活性,其中Ustilaginoidins B、I以及C4、C1对水稻种子的胚根胚芽生长表现出中等的抑制活性,在400 μg/mL的浓度下,化合物对丽江品种胚根的抑制率在60.40-68.09%之间。Ustilaginoidin I对人结肠癌细胞株(HCT116)的抑制中浓度(IC50)为4.06 μM,Ustilaginoidin J对人胃癌细胞株(BGC823)的IC50为4.98 μM,新化合物B5-2对人肺癌细胞株(NCI-H1650)、人胃癌细胞株(BGC823)、人髓母细胞瘤细胞株(Daoy)、人肝癌细胞株(HepG2)均有一定的抑制活性。(3)采用高速逆流色谱(HSCCC)的方法对稻曲球中7个Ustilaginoidins进行了分离和制备条件的筛选,采用3个溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(6.5:3.5:5.0:5.0,4.0:5.0:5.0:6.0,3.0:5.0:4.0:6.7,v/v)可对 Ustilaginoidins A、G、B、H、I、C、J 进行有效的分离,有 6.2 mg 的Ustilaginoidin A、5.1 mg 的 Ustilaginoidin G、3.9 mg 的 Ustilaginoidin B、1.2 mg 的 Ustilaginoidin H、5.7 mg 的 Ustilaginoidin I、3.5 mg 的 Ustilaginoidin C 和 6.1 mg 的 Ustilaginoidin J 从共计 62 mg 的样品中分离出来,各流分的纯度均达到了 80%以上。该技术表现出了样品损失少、分离度高、操作简单、用时少等优点,为Ustilaginoidins标准品的制备提供了一种简便、高效、快捷的方法,有广阔的应用前景。(4)以稻曲球中六个主要的稻绿核菌素(Ustilaginoidins A、B、C、G、I、J)含量为测定指标,采用大孔吸附树脂对稻曲球粗提物中的稻绿核菌素进行了富集方法的优化,筛选了 20种市售树脂,其中树脂HP2MGL对目标化合物均有比较高的吸附和解吸能力,对该树脂的静态和动态吸附与解吸过程进行了优化,最佳的动态吸附条件为:样品溶液pH值6.0,浓度1.5 mg/mL,温度25℃,上样流速3.0 BV/h,上样体积24 BV;最佳解吸条件为:洗脱溶剂100%乙醇,pH值6.0,洗脱流速3.0 BV/h,洗脱体积6 BV,经树脂富集后,Ustilaginoidins A、B、C、G、I、J在粗提物中的含量分别由 4.21%、0.65%、0.37%、0.38%、0.39%、0.28%提高至 29.90%、5.27%、4.21%、4.43%、4.90%、3.05%,目标物的回收率在86.71%和91.73%之间。对另一种树脂DM130的静态和动态吸附与解吸过程也进行了优化,该树脂也能提高目标化合物的含量,但因其回收率较低,而不适合于大规模应用。(5)采用高效液相色谱法(HPLC)对稻曲球中25个稻绿核菌素的指纹图谱进行了分析,在同一条件下确定了各个化合物的保留时间(RT)、紫外吸收(UV)以及相应质谱中的分子离子([M-H]-),对混合标准品以及样品中的稻绿核菌素进行了分析和指认,进行了日内、日间重现性实验。色谱条件对混合组分有较好的分离度,各个峰的保留时间和峰面积在日内和日间重现性良好,可用于实际稻曲球样品中稻绿核菌素类化合物的定性识别。(6)将稻曲球中外部的厚垣孢子层与内部的菌丝和胚乳层分开,对厚垣孢子层用有机溶剂进行提取,并用石油醚萃取后得到其脂溶性成分,对该成分进行了硅胶柱层析分离,从中得到白色晶体,经1H NMR鉴定为麦角甾-5,7,22-三烯-3-醇。本研究从稻曲球中分离鉴定出25个稻绿核菌素,其中8个为新的化合物,7个为首次从稻曲球中获得的已知化合物,对稻绿核菌素的制备和富集等工艺进行了探索,为该类化合物的开发利用提供了依据,为稻曲病菌的代谢网络、标样体系和指纹图谱的建立、稻绿核菌素生物活性及其在致病过程中的作用等深入研究提供了基础。