第一部分C6胶质瘤旁分泌诱发BMSCs生物学特性转化目的明确C6胶质瘤培养基GCM诱导后大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)生物学特性的转变及可能涉及的分子机制。方法将4周龄SPF级雄性SD大鼠,体重50 ± 10 g处死后获取原代BMSCs。取大鼠脑胶质瘤细胞系C6的24 h培养基和新鲜培养基1:1混合,从P2代连续培养BMSCs以建立GCM培养模型。取GCM培养至P4的细胞,以正常BMSCs为对照,检测GCM培养后细胞形态,细胞周期,增殖,衰老,侵袭,迁移及裸鼠皮下成瘤能力的变化;同时使用RT-PCR,免疫荧光和Western blot分别检测Akt,STAT3,C-myc,IL-6,GFAP,Cyclin D1,Bcl-xl,Bad等和细胞增殖,凋亡以及恶性转化相关基因的mRNA和蛋白水平。随后将诱导后的BMSCs分别注入裸鼠皮下观察成瘤能力,取得肿瘤组织后冰冻切片并进行HE染色,使用Ki-67,Des,Vim,Nes,GFAP和S100B等标志物鉴定肿瘤来源。结果1.经免疫荧光和流式细胞术(FCM)鉴定,原代培养的细胞表达干细胞标志物CD73,CD90,CD105且阳性率均>95%,不表达造血系统细胞标志物CD34和CD45,表明原代BMSCs培养成功且纯度高,能够满足后续实验的需求。2.GCM培养至P4代的BMSCs细胞形态由纺缍状呈漩涡排列的成纤维状细胞逐渐变化为铺路石样细胞,细胞接触抑制能力逐渐消失并且能够形成明显的细胞集落。3.流式细胞术检测细胞周期结果显示,GCM诱导后BMSCs的G2+S期细胞比例为25.48%显著高于正常CM培养细胞的G2+S比例14.36%(P<0.01)。4.CCK-8检测诱导后细胞活力结果显示,从第三天(3d)开始GCM培养细胞的活力显著高于正常CM培养细胞,其中GCM诱导3d,4d的BMSCs细胞活力能力要高于CM组(P<0.05),GCM诱导5d-7d的BMSCs细胞活力显著高于CM组(P<0.01)。5.Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力证实,相对于正常CM培养组,GCM可以显著提高BMSCs的侵袭(P<0.05)和迁移(P<0.01)能力。6.细胞衰老β-gal染色发现,正常CM培养的P6代BMSCs的β-gal染色阳性率为53.3 ± 19.2%,而GCM培养的BMSCs阳性细胞率仅为8.1 ± 6.8%,两者差异显著(P<0.01)。7.RT-PCR检测BMSCs中mRNA水平结果显示,GCM共培养后可以提高细胞增殖相关基因Akt1,Akt2,Akt3的mRNA表达,但是在P4代细胞中以Akt1的上调最为显著(P<0.05);GCM处理可以上调BMSCs中原癌基因STAT3和C-myc的mRNA水平,但是在P4代细胞中STAT3上调并不显著,而C-myc的上调存在显著性差异(P<0.01);检测C6胶质瘤高表达基因IL-6和GFAP的mRNA发现,BMSCs中GFAP随着培养时间的延长逐渐增加并在P4代达到峰值。同时GCM还可以提高BMSCs内部IL-6 mRNA的水平,其中以P3代细胞最为显著(P<0.01)。8.免疫荧光检测细胞Akt1,p-Akt1,STAT3,p-STAT3结果显示,GCM可以增加Akt1,p-Akt1在细胞核中的表达。而GCM对STAT3的上调并不明显,但是可以显著提高p-STAT3的表达。9.Western blot 检测 Akt1,p-Akt1,STAT3,p-STAT3 结果显示,GCM能够显著增加Akt1,p-Akt1,STAT3和p-STAT3的表达水平(P<0.01),同时上调磷酸化和非磷酸化蛋白的比例(P<0.01)。同时GCM能够显著上调BMSCs中细胞周期蛋白CyclinD1,凋亡相关蛋白Bcl-xl,Bad和p-Bad的蛋白水平(P<0.01)。10.裸鼠皮下成瘤实验显示,正常BMSCs未在裸鼠皮下形成肿瘤,而经GCM培养后的BMSCs能够在裸鼠皮下形成恶性肿瘤。使用免疫组织化学染色发现,肿瘤不表达Des高表达Ki67,Vim,Nestin,GFAP和S100B等肿瘤标志物,提示该肿瘤可能是神经外胚层来源的低分化肿瘤。结论1.GCM可以诱发BMSCs产生如接触抑制消失,细胞增殖,侵袭和迁移能力提高,抗衰老,较高的G2+S期细胞比例和裸鼠皮下成瘤等诸多肿瘤细胞生物学特性。2.GCM中某些高表达的因子,能够上调 BMSCs 中 Akt,STAT3,CyclinD1,Bcl-xl 和 Bad 的 mRNA 和蛋白表达,提示这些信号通路的活化可能是诱发BMSCs恶性转变的潜在分子机制。第二部分S100B/RAGE信号通路在BMSCs恶性转化中机制探讨目的探索S100B/RAGE信号通路在C6胶质瘤旁分泌S100B诱发BMSCs恶性转化过程中的作用机制。方法使用ELISA检测BMSCs和C6培养基上清中EGF,IGF-1,PDGF-BB和S100B的浓度,以筛选GCM中高表达的细胞因子并以此为依据建立单一细胞因子培养模型。细胞免疫荧光和Western blot检测GCM培养后BMSCs中S100B和RAGE的表达变化。建立大鼠侧脑室细胞注射模型,HE染色分析BMSCs在大脑内的生长情况,并使用免疫荧光观察细胞移植内部以及周边细胞GFAP和S100B的表达。药物毒性实验以确定RAGE特异性阻断剂FPS-ZM1的最佳作用浓度。随后使用FPS分别抑制GCM和S100B处理组细胞,CCK-8法测定各组细胞生长曲线,RT-PCR和Western blot分别检测各组细胞Akt1,STAT3,RAGE,S100B,Bcl-xl和Bad等基因mRNA和蛋白水平的变化。以期揭示S100B/RAGE信号通路在GCM诱导BMSCs恶性转化过程中的作用机制。结果1.ELISA结果显示,S100B在GCM中的浓度为30.35 pg/ml显著高于BMSCs培养基中的浓度12.65 pg/ml(P<0.01);GCM培养可以上调BMSCs膜上S100B受体RAGE的蛋白表达,同时增加胞内S100B的水平。2.BMSCs颅脑注射模型冰冻切片后HE染色发现,正常BMSCs停留在注射针道附近,未见明显增殖和转移的现象。而GCM培养的BMSCs在注射区域附近呈无序状排列并且存在明显的细胞增殖以及向周边脑组织浸润和转移的现象。3.免疫荧光结果显示,在BMSCs颅脑注射模型中,大量表达S100B的细胞汇聚到BMSCs注射区域周边,形成一个高表达S100B的内环境。C6脑胶质瘤注射模型中,同样存在S100B高表达的内部微环境。体内模型表明,BMSCs在颅脑注射后会受到脑内细胞和胶质瘤细胞旁分泌S100B的共同作用。4.药物毒性实验结果显示,FPS-ZM1的工作浓度为50μM时能够同时保证细胞活力和对RAGE的抑制作用。5.CCK-8法显示,S100B能够显著增加细胞的增殖能力,并且FPS能够抑制因S100B和GCM而上调的细胞增殖能力。6.RT-PCR 检测 RAGE,S100B,Akt1,STAT3,Bcl-xl 和 Bad 的 mRNA发现,GCM和S100B培养可以显著上调BMSCs上RAGE受体和胞内S100B的mRNA水平,RAGE抑制剂FPS-ZM1处理能够显著降低因GCM和S100B诱导而升高的RAGE mRNA;GCM和S100B培养可以显著上调BMSCs中Akt1和STAT3的mRNA水平,使用RAGE抑制剂FPS-ZM1处理能够显著降低因GCM和S100B诱导而上调的Akt1 mRNA,但是未能将GCM组的STAT3恢复到处理前的水平;GCM和S100B培养可以升高凋亡相关基因Bcl-xl和Bad的mRNA,RAGE抑制剂对Bcl-xl影响不大但能够降低Bad的mRNA水平。7.Western blot检测BMSCs中蛋白发现,GCM和外源性S100B可以增加BMSCs中RAGE蛋白的表达,同时上调胞内S100B的水平,并且RAGE抑制剂FPS-ZM1能够阻断因GCM和外源性S100B引发的RAGE和胞内S100B上调,差异有显著性;GCM和外源性S100B能够上调 BMSCs 中 Akt1,p-Akt1,STAT3 和 p-STAT3,而 RAGE 抑制剂能够完全消除S100B带来Akt和STAT3信号通路的激活,但是只能部分消除GCM的作用。GCM和外源性S100B能够上调抗凋亡蛋白Bcl-xl,Bad和p-Bad的蛋白水平,RAGE抑制剂不能有效降低GCM所引起的Bcl-xl上调,却能够显著降低Bad和p-Bad的蛋白水平,说明S100B主要通过抑制促凋亡蛋白Bad来阻断BMSCs凋亡的发生。结论:1.C6胶质瘤细胞能够旁分泌高浓度的S100B到其周边微环境中,并上调BMSCs中S100B受体RAGE的水平。2.S100B能够上调BMSCs的增殖能力,并且活化Akt1,STAT3信号通路,上调Bcl-xl,Bad等凋亡调节蛋白从而抑制细胞凋亡发生。3.RAGE抑制剂FPS-ZM1能够反转因GCM和S100B诱导而引起的Akt,STAT3通路活化并下调Bad和p-Bad,提示S100B/RAGE是GCM诱发BMSCs转化的关键信号通路。