微生物编码的脱氯酶在氯代芳香族化合物的脱毒、降解方面起着关键作用,其脱氯催化机制是当前国际研究的热点。氯代芳香族化合物的脱氯方式主要有还原、巯基取代、氧化和水解,而关于水解脱氯酶的脱氯机制只有4-氯苯甲酸脱氯酶的报道,该酶系统需要3个独立酶的共同作用,且需要CoA和ATP。百菌清水解脱氯酶(Chd)是一个全新的、不依赖CoA和ATP的、能催化百菌清4位氯原子水解脱除的脱氯酶,也是第一个来源于金属β-内酰胺酶超家族的水解脱氯酶。Chd的催化机制不同于以前报道的脱氯酶,且其中的金属离子是维持其水解脱氯活性所必需的。Chd只能对百菌清的4位氯原子进行水解脱氯,而对其他氯代芳香族化合物没有脱氯效果。通过定向进化的方法可以提高Chd催化活性,甚至可以改变其底物特异性,还可为分子水平上研究Chd的催化活性位点提供帮助。通过加入金属整合剂邻菲罗啉,并透析酶液得到脱金属辅基酶(apo-Chd),再加入不同二价金属离子(Co2+,Cd2+,Mn2+,Ca2+,Zn2+,Mg2+,Hg2+,Cu2+,Ni2+,Cr2+和Fe2+)进行共培养,得到含不同二价金属离子的重组Chd。对重组酶的酶活力和酶学特性的研究结果表明Co2+-Chd的酶活比Zn2+-Chd的酶活提高了 20.3%;Cd2+-Chd和Mn2+-Chd的酶活比Zn2+-Chd酶活都有下降,分别为原来的91.6%和57%,该结果表明Chd中二价Zn2+活性中心可以被Co2+、Cd2+和Mn2+所取代。研究了重组酶的基本酶学特性。Co2+-Chd的Km值为 134μM,比Zn2+-Chd的Km值(149μM)略有减小;Cd2+-Chd和Mn2+-Chd的Km值分别为168uM和157uM,均高于Zn2+-Chd。说明了不同的金属离子替代后,改变了酶与底物的亲和力,从而改变了催化效率。对不同金属替代重组酶的最适温度、pH、热稳定性和酸碱耐受性的研究表明,Mn2+替代的酶的最适温度为50℃,和含Zn2+的野生型Chd一致,而Co2+和Cd2+替代的酶最适温度为下降为40℃。含Zn2+的野生型Chd在50℃时处理10min,相对酶活下降不足5%,处理1h后,相对酶活下降17%。而催化中心金属离子替换为Cd2+、Co2+、Mn2+时,50℃处理10min基本失活、且酶的pH活性范围较变窄,酸碱耐受性下降。从这些结果可以看出,Zn2+为Chd催化活性中心的最适配基,维持了Chd的高温下催化活性、热稳定性和酸碱稳定性。在本研究中,还利用电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AES)精确测定了Chd中金属离子的含量,再根据蛋白质浓度核算出一个Chd分子中含有2.14个锌离子(Zn2+),显示Chd的包含一个双核(Zn2+-Zn2+)催化活性中心。利用3D LigandSite(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/3dligandsite/)在线软件,预测Chd 的金属配基结合位点。根据预测的结果,结合定点突变的方法,检测突变后酶活变化,证明Chd的金属配基结合位点由H128、H131、N230、D130和H271五个氨基酸残基组成。通过易错PCR方法,获得了 4个活力提高的Chd突变体,发现总共有7个氨基酸位点发生了突变,分别是 L109H、S303G、L48H、Q146R、N168Y、L243E 和 E249D。Chd突变体中活力最高的TB-1的比酶活为47.2 IU/μg,比原始酶活提高了 2.5倍。将活力提高的突变子用DNA shuffling的方法进行片段重组。经筛选得到酶活力进一步提高的突变体TB-5,其比酶活达到69.5 IU/μg,比原始菌株的18.9 IU/μg提高了 3.7倍。测序结果显示有3个氨基酸位点发生了突变,分别是Q146R、N168Y和S303G。突变体酶动力学参数测定结果表明,突变体TB-1和TB-5的Km变小,Kcat变大,说明突变体酶与底物的亲和力提高,从而提高了酶的催化效率。