据世界卫生组织（WHO）于2015年统计结果显示,全球每年发生食源性疾病的病例数超过60亿人次,平均每10个人中就有一例感染,导致42万人死亡,食源性疾病已成为当今世界重大的公共卫生问题。由单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes,Lm）、沙门菌（Salmonellaspp.）和大肠杆菌（Escherichia coli）等病原细菌引起的食源性疾病是影响食品安全的最主要的因素之一。其中Lm引起的李斯特菌病具有高致死率的特点,早在2000年就已被WHO列入重点检测的食源性致病菌之一。Lm作为兼性胞内寄生的革兰阳性杆菌,在自然环境中广泛分布,随被污染的食物进入肠道后,可引发胃肠炎、脑膜炎、流产等临床症状。深入研究Lm的致病机理,获得与致病性相关的毒力因子和分子标识,对李斯特菌病的预防控制具有重要的意义。Lm体内致病相关毒力基因的挖掘及功能研究是揭示其致病机制的有效方法,其与宿主细胞相互作用的过程中,能根据所遇到的不同生境,随时调整多个毒力基因的表达模式,从而使细菌可在宿主中适应性生存。由于病原菌与宿主互作是一个多因子作用的复杂过程,目前对其致病性的研究已逐渐从过去对单个基因的功能研究,转变为从整体水平分析宿主和病原菌的相互作用。而转座突变技术已成为发现新基因、发掘已知基因新功能的有效途径之一,有利于我们开展高通量地体内致病毒力基因的筛选。本研究对强毒株Lm XYSN进行了比较基因组学分析,对毒力调控因子PrfA特有氨基酸突变以及新基因组岛8的功能进行了探究;另外,利用转座突变技术建立LmXYSN突变体文库,以人结肠癌上皮细胞为筛选模型,进行毒力相关基因的全基因组水平高通量筛选、鉴定与功能研究。LmXYSN毒力相关基因的挖掘及功能的解析,有利于揭示其在宿主体内适应生存的机制,为李斯特菌病的预防与控制奠定理论基础。1、LmXYSNPrfA氨基酸替换突变株的构建及生物学特性研究对31株李斯特菌毒力调控因子PrfA的比较分析显示,Lm XYSN PrfA蛋白存在两处氨基酸自然突变Lys1OAsn以及Thr151A1a。利用PyMOL软件对突变位点的氨基酸进行分析,发现位于第10位氨基酸突变改变了蛋白表面的电子分布,而第151位氨基酸突变位点则是位于PrfA变构活化热点区。由此提示,毒力调控因子PrfA氨基酸的自然突变可能影响到其调控作用,从而对LmXYSN的体内致病特性产生影响。为了研究PrfA的自然突变对Lm XYSN毒力的影响,利用同源重组技术分别构建了prfA缺失突变株Lm XYSNΔprfA以及第10位和151位氨基酸突变回复菌株Lm XYSN PrfA10K/1511T。生物学特性测定结果显示,突变株及回复株在BHI培养基中的生长能力与野生菌株一致,氨基酸替换回复突变株的溶血活性也与野生株的相同。RT-PCR检测细菌感染细胞过程中毒力岛1（LIPI-1）中基因的转录表达水平,结果显示XYSNPrfA氨基酸突变后,其mRNA表达水平比野生株降低一倍,actA、hly、plcA以及mpl转录水平显著降低,提示Lm XYSNPrfA的自然突变增强了对LIPI-1中基因的调控能力。以非吞噬细胞系Caco-2 BBE以及HeLa细胞系为体外感染模型的测定结果表明,Lm XYSN PrfA氨基酸的自然突变显著提高了细菌对Caco-2 BBE的增殖能力以及HeLa感染的黏附、侵袭以及增殖能力;而以小鼠口服感染测定的LD50结果表明,回复菌株LmXYSNPrfA10K/151T毒力比野生株降低7.34倍。上述实验结果提示,Lm XYSN PrfA蛋白第10位和151位氨基酸突变提高了prfA自身转录水平以及对LIPI-1中基因的转录表达水平,增强了Lm XYSN对非吞噬细胞的黏附侵袭能力,影响了细菌在宿主体内的致病能力。2、Lm XYSN基因组岛8突变株的构建及生物学特性研究对基因组岛8内分布的基因比对分析,选择与其它李斯特菌同源性较低的基因簇（XYSN0819、XYSN0820、XYSN0821和XYSN0822）进行功能的初步研究。采用同源重组技术对该基因簇进行敲除,并对LmXYSN ΔXYSN0819-0822不同条件下的生长能力以及不同温度下生物被膜的形成能力进行了测定。结果表明,突变株Lm XYSNΔXYSN0819-0822在BHI培养基和MEM培养中生长速率均显著低于野生株（P<0.05）,耐受1%Triton的能力显著弱于野生株（P<0.05）,且在37℃和42℃形成生物被膜的能力也显著下降（P<0.05;P<0.01）。以细胞系Caco-2 BBE、HeLa为体外感染模型、BABL/c小鼠为体内感染模型,对XYSNN₀819-0822缺失株的侵袭能力、小鼠致病能力进行测定。结果表明,XYSN.0819-0822缺失对细菌侵袭Caco-2 BBE、HeLa细胞系的胞内增殖能力造成显著影响（P<0.05）,并降低了对小鼠的致病力。上述研究结果表明,LmXYSN基因组岛8中XYSN₀819、XYSN₀820、XYSN₀821以及XYSN0822构成的基因簇参与该菌生长代谢、生物被膜形成和胞内增殖,提高其在不利环境中的抵抗能力,促进在宿主细胞中的适应性生存。3、LmXYSN新毒力相关基因的筛选及功能研究利用Mariner家族中的TnYLB-1转座元件构建了含有6000个Lm XYSN突变子的转座突变体文库,从中随机挑取1127个突变子,以人结肠癌上皮细胞系Caco-2BBE建立突变子筛选模型进行毒力相关基因的筛选,共获得增殖能力下降5倍以上的突变株15株,其中包括降低20倍以上的3株突变株。利用反向PCR（reverse PCR）和测序分析,对3株突变株的插入位点进行了鉴定,它们的转座插入位点分别位于XYSN₀462、XYSN₁095以及XYSN₁098中。其中XYSN0462是已知的在感染非吞噬细胞中发挥重要作用的内化素基因inlA,由此证明本研究采用的细胞模型筛选LmXYSN毒力因子方法的可行性。对XYSN1095::Tn和XYSN₁098::Tn在BHI培养基中生长能力测定结果显示,基因的插入失活对细菌的生长能力未造成明显影响。通过扫描电子显微镜对细菌形态进行观察则发现,XYSN1095::Tn和XYSN₁098::Tn的菌体变短且部分菌体发生弯曲。对Caco-2 BBE的黏附、侵袭以及胞内增殖能力进行测定结果表明,XYSN₁095和XYSN₁098的基因突变,极显著降低了细菌的侵袭与增殖能力。同时,对XYSN₁095::Tn以及XYSN₁098::Tn 口服感染BABL/c小鼠LD50测定结果显示,XYSN₁095::Tn的毒力（LD50=1010.24CFU）比LmXYSN（LD50=105.08CFU）降低了 105.16倍;且XYSY₁098::Tn的毒力（LD50>2×10.6CFU）比野生株降低了 105倍以上,提示XYSN1095和XYSN₁098是Lm XYSN的重要毒力相关基因,在其感染与致病中发挥重要作用。