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大鼠永久性的双侧颈总动脉闭塞(bilateral occlusion of the common carotid artereis,2VO)建立的慢性脑低灌注(chronic cerebral hypoperfusion,CCH)模型是目前最为广泛应用血管源性痴呆与认知障碍模型,CCH模型中神经元保护(尤其在海马区域)成为了重要的改善认知能力的手段。我们和国内外其他团队的先前研究发现神经调节蛋白1(Neuregulin1,NRG1)以及其主要的受体酪氨酸激酶ErbB4信号系统的功能障碍可导致如神经元凋亡等直接神经元损伤;再者,据报道高迁移率族蛋白1(High mobility group box-1,HMGB1)激活后作为一种重要的促炎性信号分子在CCH模型中参与了神经炎性反应引起的间接(延迟/二次)神经元损伤。这些信号系统的表达模式以及调控对CCH动物模型的影响尚未有系统研究。另外,国内外包括我们的前期研究证实间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)以及间充质干细胞源性外泌体(MSCs-derived exosomes,MSC-exo)具有明显的免疫调控和神经保护功能,相比单纯细胞治疗,MSC-Exo易于透过血脑屏障,规避细胞致瘤风险,方便冻融保存(-20℃)等等,综合提示MSC-Exo可能成为临床更理想的神经保护剂。本研究在此基础上,进一步探究了与神经保护相关的信号机制(NRG1/ErbB4和HMGB1信号系统),并初步探讨了MSC-exo对CCH模型的宏观治疗作用以及对以上信号系统的调控作用。具体分为以下三部分:内容一:NRG1/ErbB4信号系统功能障碍介导的直接神经元损伤及其调控实验一:CCH模型中NRG1/ErbB4的表达与神经元凋亡相关性分析目的:本研究旨在探讨2VO诱导的CCH大鼠模型海马区域NRG1/ErbB4的变化及其与神经元凋亡的相关性。方法:采用SD大鼠2VO手术构建CCH大鼠模型。Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)以及NeuN染色用于观察2VO大鼠造模后的海马依赖性认知功能和CA1区域神经元损伤,而酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹(Western blotting)和间接免疫荧光染色等用于观察2VO大鼠海马NRG1/ErbB4的表达变化以及ErbB4的共表达模式改变;通过原位末端标记法(TdT-mediated nick end labeling,TUNEL)染色和蛋白印迹分析凋亡和ErbB4相关蛋白的表达。统计TUNEL阳性细胞数以及NRG1、ErbB4表达水平,并进行Pearson相关性分析。结果:2VO可以引起显著的认知缺陷和神经元凋亡。海马CA1 NRG1(ELISA)和ErbB4(免疫荧光)表达水平在2VO组呈现明显下降。Pearson相关性分析显示NRG1/ErbB4的表达与神经元凋亡直接相关(NRG1:r=-0.869,P=0.025<0.05;ErbB4:r=-0.859,P=0.029<0.05)。结论:表明海马NRG1/ErbB4信号系统可能参与CCH的疾病进展,尤其是CCH过程中的神经元凋亡。实验二:ErbB4介导的NRG1对认知改善和海马CA1区神经元保护作用目的:通过使用ErbB4特异性抑制剂AG1478来进一步研究NRG1在CCH大鼠模型中的保护作用,并阐明ErbB4受体是否参与介导NRG1神经保护作用。方法:采用SD大鼠构建CCH模型,进行2VO或假手术(sham)。NRG1(100μM)和AG1478(50 mM)立体定向注射入CCH大鼠侧脑室内后8周(w),采用Morris水迷宫(MWM)和八臂水迷宫(radial-armed water maze,RAWM)检测认知功能障碍,分别采用NeuN和TUNEL染色对海马CA1神经元的存活和凋亡进行组织学评价。蛋白印迹检测凋亡相关蛋白表达及ErbB4活化(pErbB4/ErbB4)情况。结果:NRG1明显改善了MWM(空间学习和记忆)和RAWM(空间工作和参考记忆)相关表现,下调了海马CA1神经元损伤和细胞凋亡,上调了pErbB4/ErbB4和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平,与此同时也下调了促凋亡蛋白如Cl-caspase3和Bax的表达。此外,AG1478的介入部分抵消了NRG1的保护作用。结论:NRG1可部分通过ErbB4受体来改善CCH大鼠的认知障碍和神经元凋亡。内容二:HMGB1介导的神经炎性反应相关间接神经元损伤及其调控目的:探究HMGB1中和抗体对2VO诱导的CCH模型HMGB1信号的调控以及对神经炎症的抑制作用;方法:SD大鼠接受2VO或假手术(sham)。术后静脉注射PBS或HMGB1中和抗体(1 mg/kg)或对照IgG抗体(1 mg/kg)。在3 d时评估HMGB1核转位、血脑屏障(BBB)通透性、胶质细胞激活,炎性细胞因子和氧化应激水平。另于3 d、4 w和12 w进行NeuN免疫染色和Morris水迷宫(MWM);结果:HMGB1抗体能抑制海马CA1亚区HMGB1易位,提高海马HMGB1水平。此外,抗HMGB1抗体在3 d时保持了BBB的完整性,减少了胶质细胞的活化,同时调控了氧化应激水平和炎性细胞因子水平。在慢性期(4 w和12 w),抗HMGB1中和抗体可以改善海马CA1神经元的存活率和MWM实验中的行为学水平。结论:HMGB1中和抗体在急性期抑制海马炎症反应和氧化应激,这些变化在慢性期CCH中发挥长期的有益作用,提示拮抗HMGB1相关信号通路对CCH大鼠模型神经保护和认知功能的积极作用。内容三:MSC-exo对CCH模型认知改善和海马CA1区神经保护作用及分子机制初探目的:初步探索MSC-exo对CCH大鼠模型海马CA1区域神经保护作用及可能的分子机制。方法:SD大鼠随机分为三组:假手术组(Sham组,仅注射PBS),2VO组(2VO手术)和2VO+MSC-exo组(2VO手术后2 h进行MSC-exo侧脑室立体定向注射)。体外对MSC超速离心后分离的exo进行鉴定(CD81/CD63,透射电镜以及纳米颗粒追踪分析等)。在2VO术后28 d进行Morris水迷宫(MWM)分析行为学改善,同时进行蛋白印迹和间接免疫荧光染色分析其对神经元保护和ErbB4(ErbB4&NeuN表达水平和pErbB4/ErbB4的蛋白表达水平)以及HMGB1信号(HMGB1核易位、TLR2、TLR4)的调控作用。结果:MSC-exo表达CD81和CD63表面标志物并且在透射电镜下呈现典型形态,纳米颗粒追踪分析发现分离物的粒径大小在40-150 nm左右;体内立体定向注射后发现,MSC-exo可明显改善MWM空间学习和记忆能力相关表现,并发挥神经保护作用(NeuN阳性细胞数以及TUNEL染色的凋亡系数)以及神经炎性反应的抑制作用(Iba1以及GFAP表达水平的调控)。最后,MSC-exo可明显上调ErbB4&NeuN阳性细胞数量和pErbB4/ErbB4表达水平,并下调HMGB1在神经元中的核易位以及HMGB1下游TLR2/4的表达。结论:MSCs-exo立体定向注射可明显减轻CCH大鼠模型认知障碍并起到海马CA1区神经元保护作用。而MSCs-exo以上作用可能通过调控ErbB4的表达以及抑制HMGB1的激活来实现。