棉花是世界上最重要的天然纺织纤维作物,全球每年纤维总需求的约35%由棉花纤维提供。棉花纤维是起源于胚珠表皮的单细胞,其发育历经起始、伸长、次生壁生物合成和成熟4个阶段。赤霉素（GA）是一种重要的植物激素,在整个植物生命周期中调节各种生长发育过程。GA对棉花纤维发育有着深远的影响。例如提高棉花纤维中的GA水平可以增加成熟纤维的长度以及纤维细胞壁厚度。近些年来,虽然有许多研究者从不同角度去解析GA调控棉花纤维发育的机制,然而GA促进棉花纤维细胞伸长和次生壁合成的机制依然尚未全面阐述清楚。DELLA蛋白是GA信号的关键负调控因子,它抑制几乎所有已知的GA依赖过程。在植物体中,当缺乏GA时,DELLA蛋白在细胞中积累并抑制GA反应;当GA存在时,GID1与DELLA蛋白结合形成GA-GID1-DELLA复合体,促进DELLA蛋白泛素化降解,进而激活被DELLA蛋白抑制的GA响应基因,实现植物响应GA信号。为了进一步探究GA,特别是DELLA蛋白在棉花纤维发育中的功能,首先以棉花茎的发育过程为对象,初步探讨了DELLA蛋白对棉花茎发育的影响。其次,以纤维伸长时期特异启动子pro E6和次生壁合成时期特异启动子pro Fb L2A驱动一个DELLA功能获得型突变体ΔGAI的表达,深入研究DELLA蛋白在调节棉花纤维发育过程中的作用与机制。主要结果内容如下。1、DELLA蛋白调控棉花茎的伸长与次生壁形成首先对课题组前期获得的超量表达赤霉素合成酶基因GhGA20ox的转基因棉花节间长度和节间直径进行统计,结果显示提高GA水平,可促进早期节间伸长和增粗。外施生物活性GA以及GA生物合成抑制剂多效唑（PAC）分别促进和抑制茎的伸长和木质化作用。Western blot分析表明,GA和PAC分别促进了GhGAI1的降解和积累。为了进一步研究DELLA基因家族在茎发育中的潜在功能,采用农杆菌介导的病毒诱导基因沉默（VIGS）方法下调陆地棉GhGAIs的表达。与对照相比,GhGAI1＆2-、GhGAI3＆4-和GhGAI1＆2＆3＆4-沉默植株第一节间的长度和直径均有所增加,这与GA处理一致。显微观察结果表明,GhGAI1＆2-沉默植株第一节间的细胞长度、木质部和韧皮部的木质化程度显著增加。上述结果表明,GA可通过GhGAIs调控棉花茎的伸长和木质化过程,其中cladeⅠ和cladeⅡ的DELLAs均参与了这一过程,但cladeⅠ在茎发育过程中起主导作用。此外,我们对第一节间进行转录组分析,寻找受GhGAI1＆2调控的基因。GhGAI1＆2-沉默植株中有97个基因表达上调,94个基因表达下调。KEGG通路分析表明,上调基因主要富集苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、玉米素生物合成等通路。q RT-PCR验证次生壁形成相关基因的表达水平。结果表明次生壁形成相关的纤维素生物合成基因（Ces A4,Ces A7和Ces A8）,半纤维素生物合成基因（IRX9和IRX14）,木质素单体生物合成（PAL,4CL,CCo AOMT和F5H）和聚合基因（LAC4、PER4和PER21）均在GhGAI1＆2沉默植株中上调表达。这些基因的表达水平也受GA处理诱导而受PAC处理抑制。这些结果表明,DELLA蛋白通过调控与纤维素合成、半纤维素合成以及木质素单体合成和聚合相关的基因来介导GA信号调控次生壁的形成。为了探究棉花茎发育过程中GA-DELLA信号与次生壁发育之间的联系,我们还研究了GhGAIs与棉花次生壁形成相关NAC转录因子之间的相互作用。结果表明,GhGAI1A/D可以与各层次的次生壁形成相关NAC转录因子相互作用,沉默这些与DELLA互作的NACs（Gh SND2、Gh FSNs和Gh VND4s）会抑制棉花茎中次生壁的形成。2、DELLA蛋白抑制棉花纤维次生壁沉积为了在棉花纤维次生壁合成时期特异上调GA信号负调控因子DELLA蛋白,利用纤维次生壁合成时期特异启动子pro Fb L2A驱动表达ΔGAI。经棉花遗传转化,成功获得多个pro Fb L2A:ΔGAI转基因棉花独立转化子。对pro Fb L2A:ΔGAI转基因棉花深入分析发现,ΔGAI在纤维次生壁合成时期的转录水平和蛋白水平均高丰度存在。对pro Fb L2A:ΔGAI转基因棉花成熟纤维深入分析发现纤维长度无明显变化,但衣分和衣指均显著下降;纤维品质分析表明,成熟纤维马克隆值在多个转化子连续4个世代中显著降低;石蜡切片分析证实这些纤维品质的改变是由于成熟纤维细胞壁变薄引起的。由此可见,纤维细胞次生壁合成时期积累DELLA蛋白,抑制次生壁合成并降低成熟纤维马克隆值。为了阐明DELLA如何影响棉花纤维次生壁发育,我们观察了pro Fb L2A:ΔGAI转基因棉花纤维进入次生壁发育阶段的时间,结果表明,转基因纤维在进入次生壁的时间与对照没有差异,但结晶纤维素沉积的强度明显弱于对照。18 DPA的纤维转录组测序分析发现转基因与对照有317个表达差异基因（其中上调174个,下调143个）。KEGG富集分析显示,淀粉与蔗糖代谢途径,戊糖、葡萄糖醛酸转换途径具有显著性,表明超量表达ΔGAI影响纤维中的糖代谢过程。诸多次生壁合成相关基因如纤维素合酶Ces A、蔗糖合酶Su S以及木聚糖合成相关基因IRX等均下调明显;此外,多个调控次生壁合成相关的NAC、MYB转录因子的转录水平有下降趋势。由此可见,DELLA可影响糖代谢,并影响次生壁组分合成进而调控次生细胞壁的发育。DELLA蛋白的重要功能主要依赖于它与各种调节蛋白建立蛋白相互作用的能力。我们检测到一些纤维次生壁时期优势表达的转录因子,如Gh NAC56、Gh NAC45、Gh WRKY46、Ghb HLH110、Gh CCCH49、Gh FNS1与GhGAI1A/D存在互作。其中Gh FSN1是一个已报道的纤维次生壁发育正调控因子。通过对pro Fb L2A:ΔGAI和FSN1-OE转录组联合分析发现,受Gh FSN1上调的与次生壁相关的基因,如Ces A7、SUS、CTL、KOR、FLA、COBL、BXL、IRX7、IRX15等在pro Fb L2A:ΔGAI的纤维中被抑制。GhGAI1与Gh FSN1之间的相互作用导致GhGAI1抑制Gh FSN1对其下游靶基因如MYBL1、KNL1、DUF231L1、IRX12的转录激活作用。这些结果表明,在棉花纤维次生壁合成阶段,DELLA蛋白与以Gh FSN1为代表的纤维次生壁正调控因子相互作用,抑制其下游次生壁合成相关基因的表达,从而抑制纤维次生壁合成。3、DELLA蛋白抑制棉花纤维伸长GA可以促进纤维伸长,为了进一步探究GA-DELLA信号调控纤维伸长的机制,我们采用纤维伸长期特异启动子pro E6驱动ΔGAI的表达,并通过棉花遗传转化获得多个pro E6:ΔGAI转基因棉花。经检测,ΔGAI特异在这些转基因棉花的纤维伸长期表达,并且ΔGAI蛋白丰度在纤维发育前期保持高水平。对成熟纤维长度统计发现,纤维长度减少5～12mm,并且纤维长度与ΔGAI表达水平呈负相关。追踪纤维伸长过程发现pro E6:ΔGAI转基因棉花在起始阶段与对照无明显差异;进入纤维伸长阶段后,pro E6:ΔGAI转基因纤维伸长速率明显落后于野生型,并持续到纤维进入次生壁发育阶段;但pro E6:ΔGAI转基因纤维在进入次生壁发育阶段的时间上与野生型无明显差异。为了深入理解ΔGAI对纤维伸长的抑制作用,通过检测内源激素水平发现,在pro E6:ΔGAI的纤维中GA、IAA水平显著上升,而ABA、乙烯前体ACC水平显著降低。同时还发现与纤维伸长密切相关的己糖（主要为果糖和葡萄糖）水平以及ROS水平也都在pro E6:ΔGAI的纤维中显著降低。进一步,通过Bi FC筛选棉花纤维伸长期优势表达的DELLA互作蛋白,结果显示7个纤维伸长期优势表达的转录因子（Ghb ZIP61-1、Ghb ZIP61-2、Gh ILR3、Gh NAC31、Gh MYB66、Gh MYBL、Gh ODO1）均能与DELLA蛋白互作。这些结果表明,DELLA蛋白与多种转录因子相互作用,形成一个多层次、多途径的复杂调控网络,抑制这些转录因子对纤维伸长的正调控作用,通过激素水平、VLCFA-乙烯途径、糖代谢、ROS水平等抑制纤维伸长。