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副猪嗜血杆菌（Haemophlius parasuis，HPS）可以导致猪格拉瑟氏病，同时会引发肺炎等相关疾病，是呼吸道疾病相关的主要致病菌之一，在经济方面及养猪的品质方面带来极大损害；因此，快速诊断该菌及鉴别该菌不同血清型菌株日益重要，在检测该病时，需要一定的方法及策略。传统检测分型一般操作冗杂，仪器贵不实用，在个体、基层或微企业很难应用。而环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）使用方便，价格低廉，所以建立LAMP检测方法，用于HPS的分型就显得日益重要，它不仅能在现场时刻进行检测，同时也能大量进行普及推广。主要内容如下：
1.副猪嗜血杆菌的分离鉴定
在中国河南周边地区调查收集疑似的病料组织，共计813份样品进行分离鉴定，这些病料来自于发病猪，这些猪的肺脏、关节、脑脊液等样品具有HPS病典型的临床特征。培养分离该菌的TSA培养基必须添加生长因子NAD，以及犊牛血清，培养之后进行分离与鉴定。经常规检测操作革兰氏染色试验，在附以PCR方法对分离的菌株进行分子鉴定，取阳性PCR产物送去测序与分析，经过比对分析，阳性菌株扩增序列与国内外HPS核苷酸相似性高达98.6%～99.9%，在氨基酸方面相似性为99.0%～100.0%，分离出的副猪嗜血杆菌共63株。HPS总共分离率的数量为7.75%（63/813），在这3年期间的分离率介于5.49%(13/237)～11.31%（19/168）。
2.四种血清型副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立
基于不同血清型副猪嗜血杆菌的荚膜多糖基因座内的基因序列差异，可快速进行分子血清型分型。分别建立快速检测HPS1、4、5、11型的单一PCR检测方法，通过优化引物浓度、退火温度等，1、4、5、11型副猪嗜血杆菌的PCR检测结果依次显示为：引物最适浓度分别为0.3μM、0.4μM、0.4μM、0.4μM，反应的最适退火温度分别为51℃、53℃、55℃、57℃时，四种血清型PCR反应体系检测效果最佳。利用本实验建立的方法分别检测四种血清型副猪嗜血杆菌、其它血清型副猪嗜血杆菌及其他种属细菌病毒，Hps1、4、5、11型PCR中分别仅扩增出180bp、320bp、450bp、890bp单一目的条带，没有非特异性扩增，表明PCR方法扩增单一特异。对重复性方面、敏感性方面进行了检测；结果表明，1、4、5、11型PCR方法最低检测限分别为13.5pg/μL、24.1pg/μL、17.1pg/μL、14.9pg/μL，具有较好的稳定性。
3.四种血清型副猪嗜血杆菌mPCR检测方法的建立
本研究依据HPS1、4、5、11型分别对应的funB、wciP、wcwk、amtA基因序列各设计一对引物，同时选取四种血清型的保守序列HPS16S rRNA基因序列，采用软件设计引物，通过比较分析引物二聚体、互补性分析及同源性，分别依次构建了检测HPS1、4、5、11型的mPCR方法；通过PCR条件的摸索，在此基础上优化双重PCR的反应体系、条件，一般包含退火温度、引物浓度等的优化，检测分析了敏感性、特异性、重复性。按照建立的mPCR方法对四种血清型funB、wciP、wcwK、amtA及HPS16S rRNA基因分别进行检测验证，结果显示：当四种血清型HPS的引物浓度分别为0.35μM、0.4μM、0.45μM、0.45μM及反应最适合的退火温度依次为51.5℃、53.5℃、56℃、57℃时，四种血清型mPCR反应体系检测效果分别最佳。此外，本方法只能检测出同型的副猪嗜血杆菌菌株，而其他血清型及其他种属菌株不能检测出；敏感性试验结果表明该方法能检测出1、4、5和11型的最低核酸浓度分别达到11.6pg/μL、19.3pg/μL、10.7pg/μL、9.6pg/μL；重复性试验结果一致。证明该方法特异、灵敏、重复稳定。
4.四种血清型副猪嗜血杆菌LAMP检测方法的建立
本试验依据HPS1、4、5、11型分别对应的funB、wciP、wcwk、amtA基因为靶标，一般采用Primer Explorer V5在线软件，按照操作进行LAMP引物设计，根据LAMP引物设计的标准规则，选出最佳引物序列。以提取四种血清型DNA分别作为模板及分别对应最佳引物进行LAMP扩增。分别针对四种血清型筛选出最佳引物序列；并对试验反应条件、反应体系进行优化。1、4、5、11型副猪嗜血杆菌LAMP检测结果显示：当Mg2+终浓度分别为6mM、2mM、4mM、6mM时、dNTPs终浓度分别为3mM、3mM、3mM、3mM，引物比分别为1:4、1:4、1:4、1:4,反应最佳温度分别为62℃、62℃、63℃、63℃，经优化检测，验证该LAMP体系、条件优化地较好，一般60min内反应完全。通过对反应体系和反应条件摸索后，建立了四种血清型LAMP检测方法。四种血清型HPS LAMP检测方法最低检出限分别为1.35pg/μL、0.241pg/μL、0.171pg/μL、0.149pg/μL，敏感性良好，与其他血清型猪HPS及其他种属菌株不存在交叉反应。LAMP检测方法简便，经济，直观。此外，它不需要其他辅助设备，因此该检测方法在基层地区、临时检测具有广阔前景。
1.副猪嗜血杆菌的分离鉴定
在中国河南周边地区调查收集疑似的病料组织，共计813份样品进行分离鉴定，这些病料来自于发病猪，这些猪的肺脏、关节、脑脊液等样品具有HPS病典型的临床特征。培养分离该菌的TSA培养基必须添加生长因子NAD，以及犊牛血清，培养之后进行分离与鉴定。经常规检测操作革兰氏染色试验，在附以PCR方法对分离的菌株进行分子鉴定，取阳性PCR产物送去测序与分析，经过比对分析，阳性菌株扩增序列与国内外HPS核苷酸相似性高达98.6%～99.9%，在氨基酸方面相似性为99.0%～100.0%，分离出的副猪嗜血杆菌共63株。HPS总共分离率的数量为7.75%（63/813），在这3年期间的分离率介于5.49%(13/237)～11.31%（19/168）。
2.四种血清型副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立
基于不同血清型副猪嗜血杆菌的荚膜多糖基因座内的基因序列差异，可快速进行分子血清型分型。分别建立快速检测HPS1、4、5、11型的单一PCR检测方法，通过优化引物浓度、退火温度等，1、4、5、11型副猪嗜血杆菌的PCR检测结果依次显示为：引物最适浓度分别为0.3μM、0.4μM、0.4μM、0.4μM，反应的最适退火温度分别为51℃、53℃、55℃、57℃时，四种血清型PCR反应体系检测效果最佳。利用本实验建立的方法分别检测四种血清型副猪嗜血杆菌、其它血清型副猪嗜血杆菌及其他种属细菌病毒，Hps1、4、5、11型PCR中分别仅扩增出180bp、320bp、450bp、890bp单一目的条带，没有非特异性扩增，表明PCR方法扩增单一特异。对重复性方面、敏感性方面进行了检测；结果表明，1、4、5、11型PCR方法最低检测限分别为13.5pg/μL、24.1pg/μL、17.1pg/μL、14.9pg/μL，具有较好的稳定性。
3.四种血清型副猪嗜血杆菌mPCR检测方法的建立
本研究依据HPS1、4、5、11型分别对应的funB、wciP、wcwk、amtA基因序列各设计一对引物，同时选取四种血清型的保守序列HPS16S rRNA基因序列，采用软件设计引物，通过比较分析引物二聚体、互补性分析及同源性，分别依次构建了检测HPS1、4、5、11型的mPCR方法；通过PCR条件的摸索，在此基础上优化双重PCR的反应体系、条件，一般包含退火温度、引物浓度等的优化，检测分析了敏感性、特异性、重复性。按照建立的mPCR方法对四种血清型funB、wciP、wcwK、amtA及HPS16S rRNA基因分别进行检测验证，结果显示：当四种血清型HPS的引物浓度分别为0.35μM、0.4μM、0.45μM、0.45μM及反应最适合的退火温度依次为51.5℃、53.5℃、56℃、57℃时，四种血清型mPCR反应体系检测效果分别最佳。此外，本方法只能检测出同型的副猪嗜血杆菌菌株，而其他血清型及其他种属菌株不能检测出；敏感性试验结果表明该方法能检测出1、4、5和11型的最低核酸浓度分别达到11.6pg/μL、19.3pg/μL、10.7pg/μL、9.6pg/μL；重复性试验结果一致。证明该方法特异、灵敏、重复稳定。
4.四种血清型副猪嗜血杆菌LAMP检测方法的建立
本试验依据HPS1、4、5、11型分别对应的funB、wciP、wcwk、amtA基因为靶标，一般采用Primer Explorer V5在线软件，按照操作进行LAMP引物设计，根据LAMP引物设计的标准规则，选出最佳引物序列。以提取四种血清型DNA分别作为模板及分别对应最佳引物进行LAMP扩增。分别针对四种血清型筛选出最佳引物序列；并对试验反应条件、反应体系进行优化。1、4、5、11型副猪嗜血杆菌LAMP检测结果显示：当Mg2+终浓度分别为6mM、2mM、4mM、6mM时、dNTPs终浓度分别为3mM、3mM、3mM、3mM，引物比分别为1:4、1:4、1:4、1:4,反应最佳温度分别为62℃、62℃、63℃、63℃，经优化检测，验证该LAMP体系、条件优化地较好，一般60min内反应完全。通过对反应体系和反应条件摸索后，建立了四种血清型LAMP检测方法。四种血清型HPS LAMP检测方法最低检出限分别为1.35pg/μL、0.241pg/μL、0.171pg/μL、0.149pg/μL，敏感性良好，与其他血清型猪HPS及其他种属菌株不存在交叉反应。LAMP检测方法简便，经济，直观。此外，它不需要其他辅助设备，因此该检测方法在基层地区、临时检测具有广阔前景。