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目的: ASC( apoptosis associated speck—like protein containing CARD)是一种抑癌基因,又称为与甲基化相关的基因沉默的下游靶向物,可编码pyrin区(a pyrin domain,PYD)和caspase聚集区(a caspase recruitment domain,CARD),而这二种蛋白区在调节凋亡和免疫反应中均起到重要作用,许多含PYD和CARD的蛋白突变与自身免疫性疾病、癌症的发生有关。然而,在人结肠癌细胞株中ASC基因甲基化状态与凋亡的相关性还尚未阐明清楚。本实验探讨人结肠癌细胞株LS174T、LoVo和SW480中ASC基因的甲基化状态与凋亡的相关性。拟证明ASC的甲基化引起基因沉默,同时改变了细胞的凋亡作用,即ASC基因对肿瘤细胞的凋亡作用。方法:1.为了研究人结肠癌细胞株LS174T、LoVo和SW480中ASC基因的甲基化状态,本实验首先采用甲基化特异性PCR(MSP)检测结肠癌细胞株中ASC的表达情况,应用蛋白酶K/苯酚法和CpGenome DNA Modification Kit试剂盒,提取、纯化和修饰DNA。2.为了研究结肠癌细胞株中ASC的表达情况,再采用RT-PCR和Western blotting检测细胞株中ASC的表达情况。3.为了使ASC基因完全甲基化的结肠癌细胞株ASC基因恢复表达,本实验使用去甲基化药物5 -氮- 2 -脱氧胞苷(5-Aza-2-CdR)处理完全甲基化的细胞。4.RT-PCR检测药物作用后LS174T细胞中ASC的表达情况。5.应用流式细胞术分析ASC对细胞凋亡的影响。主要检测药物作用前后细胞凋亡的变化情况。6.应用实时荧光定量PCR检测药物作用前后caspase-3、fas、Bcl-2、c-myc、Bax和P53基因的变化情况。结果:1.MSP证明LS174T细胞ASC基因完全甲基化,LoVo细胞和SW480细胞ASC基因部分甲基化。2.RT-PCR和Western blotting均证明LS174T细胞ASC基因完全甲基化,即基因沉默;而LoVo细胞和SW480细胞部分甲基化,表达ASC。3.去甲基化药物5-氮-2-脱氧胞苷作用LS174T细胞株后,MSP证明ASC基因去甲基化,RT-PCR检测表明ASC基因恢复表达。4.流式细胞术检测LS174T细胞的凋亡情况,提示药物作用后细胞凋亡发生改变,药物作用的细胞凋亡率高于对照组。同时在免疫荧光显微镜下观察到药物作用后细胞凋亡发生改变,药物作用的细胞凋亡数高于对照组。5.应用实时荧光定量PCR检测六种凋亡基因,结果表明药物作用后凋亡基因含量改变不具有统计学意义,进一步证明ASC未通过改变上述六种基因含量而引起肿瘤细胞的凋亡。结论:MSP证明人结肠癌细胞株LoVo和SW480中ASC基因部分甲基化,LS174T细胞株ASC基因完全甲基化。在加入去甲基化药物5-氮-2-脱氧胞苷后LS174T细胞的ASC恢复表达,并且药物作用的LS174T细胞的凋亡率明显高于对照组LS174T细胞。因此我们可以进一步证明ASC是一种抑癌基因,促进细胞凋亡,具有抑制肿瘤的作用。