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目的:关节软骨缺损或病变在临床上多发。究其原因,主要是源于外部创伤以及内在与年龄增长等因素相关的软骨退化。软骨组织由于其缺乏血管,缺少相应的修复细胞及因子,导致自身修复能力有限,一旦出现软骨缺损即容易发展成为永久病变。近年来,用于软骨修复的组织工程技术取得了巨大成就。间充质干细胞作为种子细胞,因其来源广泛,易于分化,在软骨组织工程重建过程中使用最为频繁。但如何诱导间充质干细胞定向分化为软骨细胞,同时在分化后维持软骨细胞形态,使之不继续肥大分化仍是目前所面临的问题。因此,了解软骨细胞分化进程,调控软骨细胞形态在软骨修复及骨组织工程领域尤为重要。本研究利用已建立的体外诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化模型,探究HDAC4对干细胞向软骨前体细胞分化及成熟软骨细胞向肥大化软骨分化的影响,为体外构建组织工程软骨及维持软骨形态提供理论依据。另外,我们利用体外诱导软骨细胞向肥大软骨细胞分化模型,探究白藜芦醇对软骨细胞终末肥大分化进程的影响,有助进一步了解软骨细胞终末分化过程,为体外组织工程骨构建提供新的调控分子。方法和内容:本实验分为两个部分,针对干细胞软骨化和软骨细胞肥大化过程研究不同因素对分化进程及细胞形态的影响。一.HDAC4通过与HIF1α相互作用促进MSCs软骨分化(1)过表达及干扰表达HDAC4间充质干细胞(C3H10T1/2,MSCs)系的构建;利用过表达及干扰表达HDAC4慢病毒构建MSCs实验组,并使用CCK8进行细胞活力测定。将不同组MSCs分别培养于含TGF-β3的软骨诱导培养基中14天,期间使用qPCR及Western blot的方法鉴定软骨相关标志基因(Col II、Sox9)表达情况。(2)过表达及干扰表达HDAC4对MSCs软骨分化进程的影响;自MSCs软骨诱导开始,每7天回收实验各组诱导细胞mRNA及全蛋白。通过qPCR和Western blot的方法检测软骨化(Col II、Sox9)及肥大化(Runx2、Col X、Mef2C)相关基因及蛋白表达情况。并使用甲苯胺蓝染色评价细胞分化程度。(3)HDAC4促进MSCs软骨分化的机制;通过qpcr和westernblot的方法检测各组mscs诱导过程中hif1α表达情况;duolink-pla法检测hdac4与hif1α相互作用关系;使用hif1α抑制剂(2-me2oe2)及激活剂(iox2)探究hdac4-hif1α相互作用对细胞分化进程影响;使用hdac4入核抑制剂(lb-100)探究hdac4对hif1α核积累的影响。二.白藜芦醇促进软骨细胞肥大化的作用机制研究(1)体外诱导软骨细胞(atdc5)肥大化培养体系的建立及白藜芦醇安全浓度的确定;使用含t3的软骨细胞肥大化培养基中诱导atdc5细胞14天,即认为atdc5细胞进入肥大化阶段。将atdc5细胞置于含不同浓度(0、0.1、0.5、1、5、10、20μm)白藜芦醇的肥大化培养基中培养,使用cck8法检测24h及48h白藜芦醇对atdc5细胞活性的影响。(2)白藜芦醇对软骨细胞肥大化进程的影响;采用甲苯胺蓝法检测肥大化诱导14天后,实验组(1μmres)及对照组细胞外粘多糖表达情况;qpcr和westernblot检测肥大相关基因在3、7、14天表达;免疫组化检测肥大化标志colx和runx2表达。(3)白藜芦醇促进软骨细胞肥大化的机制;qpcr检测3、7、14天wnt、ihh及pi3k通路相关基因表达水平。结果:一.hdac4通过与hif1α相互作用促进mscs软骨分化(1)构建过表达及抑制表达hdac4间充质干细胞(c3h10t1/2,mscs)系;慢病毒转染阳性率随moi值升高而升高,综合考虑cck8测得细胞活力差异,最终使用moi500进行后续实验;与对照组(lv.control)相比,过表达组(lv.hdac4)细胞内hdac4的mrna及蛋白水平均显著提升。同样的,与干扰对照组(si.control)相比,干扰组(si.hdac4)hdac4表达量降低;qpcr检测诱导期间软骨标志基因表达水平下降。(2)研究过表达及干扰表达hdac4对mscs软骨分化进程的影响;在软骨诱导培养体系中,lv.hdac4组中colii及sox9表达水平均显著提升;同时,甲苯胺蓝染色结果也显示lv.hdac4组mscs细胞外多糖分泌量更多。而si.hdac4组细胞在诱导过程中软骨分化标志基因(colii、sox9)表达受到抑制;si.hdac4组中肥大化标志基因runx2、colx及mef2c表达在分化末期较对照组(si.control)均增加。(3)探究hdac4促进mscs软骨分化的机制;与Lv.Control相比,Lv.HDAC4组细胞内HIF1α含量更高,而si.HDAC4组则较si.Control组更少;免疫荧光染色结果与Western Blot结果一致,且si.HDAC4组中HIF1α主要集中于核内,而Lv.HDAC4组中HIF1α在胞浆内也有广泛分布;Duolink-PLA结果显示HDAC4与HIF1α间存在直接相互作用;在Lv.HDAC4组中使用HIF1α抑制剂(2-Me2OE2)后,软骨分化相关基因表达下降;而在si.HDAC4组中使用HIF1α激活剂(IOX2)后,Col II、Sox9表达升高;另外,在Lv.HDAC4组中使用HDAC4入核抑制剂(LB-100),HIF1α的核积累量明显降低;二.白藜芦醇促进软骨细胞肥大化的作用机制研究(1)确定白藜芦醇安全浓度在软骨细胞肥大化培养基中诱导14天,通过检测肥大化相应基因表达,即认为ATDC5细胞进入肥大化阶段;CCK8法确定RES安全使用浓度为1μM;(2)研究白藜芦醇对软骨细胞肥大化进程的影响与对照组相比,在肥大化诱导14天后,RES组ATDC5细胞肥大化水平明显提升;RES组肥大化相关基因表达量在3、7、14天时明显增加;RES组免疫组化检测Col X和Runx2表达较对照组升高。(3)探究白藜芦醇促进软骨细胞肥大化的机制qPCR结果显示,WNT和IHH途径中促肥大化因子β-catenin和GLI2的表达水平在RES组较对照组升高,而GLI3表达水平下降;FGF途径中PI3K的表达水平较对照组没有变化。总结:基于体外诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化模型,我们发现HDAC4通过与HIF1α直接相互作用促进MSCs软骨分化。HDAC4的核转运过程与HIF1α的核积累相关。这些结果表明,HDAC4是一个软骨重建过程中维持软骨形态关键因子,为后续组织工程软骨重建提供理论依据。另外,我们利用体外诱导软骨细胞肥大分化模型,研究RES对软骨细胞终末分化影响时发现RES通过激活β-catenin及GLI2,抑制GLI3,促进Runx2表达,实现促进ATDC5肥大分化。此结果表明RES可以作为一种潜在分子,有望应用于基于软骨内成骨的骨损伤修复。