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体细胞核移植技术效率不高是制约该技术应用的重要原因之一。研究发现,与体内发育或体外受精胚胎相比,克隆胚胎在表观遗传修饰、母源-合子转换、多能性维持方面均存在较大差异。泛素蛋白酶体通路是真核细胞内主要的蛋白质降解途径,其参与了细胞周期进程,基因转录调控、表观遗传修饰、生殖细胞发生以及早期胚胎发育等生命活动。有研究发现,在卵母细胞体外成熟或重构胚融合/激活阶段,添加蛋白酶体抑制剂MG132能够提高哺乳动物核移植胚胎的发育能力,并提高克隆动物的妊娠率,说明泛素蛋白酶体通路对克隆胚胎发育起着重要的作用。为了进一步了解泛素蛋白酶体通路对猪卵母细胞体外成熟以及广西德保黑猪体细胞核移植胚胎发育的调控机理,本研究首先研究了 MG132处理对猪卵母细胞核质成熟的影响,并通过观察其对德保黑猪体细胞核移植胚胎发育潜能的影响,确定其较优化处理方法。通过分析母源-合子转换、多能性基因表达以及表观遗传修饰变化等,以进一步了解泛素蛋白酶体通路在核移植胚胎发育中的作用机理,为提高德保黑猪体细胞核移植效率奠定基础。1.MG132处理对卵母细胞成熟以及德保黑猪核移植胚胎发育能力的影响首先,为了解MG132处理对卵母细胞核、质成熟的影响,在猪卵母细胞体外成熟30-42 h时间段添加不同浓度MG132。醋酸地衣红染色结果显示,不同浓度MG132处理的猪卵母细胞,其到达MⅡ期的比率没有显著差异(P>0.05)。对成熟后卵母细胞活性氧检测发现,随着MG132浓度的升高,成熟卵母细胞的ROS水平呈现先降低后升高的趋势。与未处理组相比,1、2.5、5μmol/L组ROS水平显著降低(P<0.05),10μmol/L组与其他各组间差异均不显著(P>0.05)。皮质颗粒染色结果显示,1μmol/LMG132处理能够提升成熟卵母细胞皮质颗粒完全迁移至皮质区(类型Ⅰ)的比率,与未处理组之间没有显著差异(P>0.05);同时,随着MG132浓度的升高,其他3个处理组类型Ⅰ卵母细胞的比率显著降低(P<0.05)。其次,对MG132处理卵母细胞及核移植胚胎条件进行了优化。首先在猪卵母细胞成熟过程中添加不同浓度MG132,以成熟后的卵母细胞进行核移植。结果发现,1 μmol/L组的胚胎分裂率显著高于未处理组和2.5、5μmol/L组(69.61%vs 58.91%,60.32%,60.87%,P<0.05);与未处理组相比,1 μmol/L组的囊胚率无显著变化(14.71%vs 11.02%,P>0.05),但显著高于2.5、5、10 μmol/L 组(14.71%vs 9.52%,8.70%,6.57%,P<0.05)。其次,以未处理的卵母细胞进行核移植操作,采用不同浓度MG132处理融合/激活后重构胚。结果显示,5μmol/L组的囊胚率显著高于未处理组和1、10μmol/L组(26.16%vs 15.50%,18.01%,16.67%,P<0.05),但与 2.5μmol/L 组(21.39%)差异不显著(P>0.05)。最后,采用1μmol/L MG132处理未成熟猪卵母细胞,经过MG132处理的卵母细胞成熟后用于生产核移植重构胚,随后用不同浓度MG132处理融合/激活后重构胚,设未经MG132处理的核移植重构胚为对照组。结果显示,5 μmol/L组的囊胚率显著高于对照组和 1、2.5、10μmol/L 组(36.51%vs14.40%,23.33%,21.54%,7.02%,P<0.05),5μmol/L组的囊胚细胞总数显著高于对照组和1、10μmol/L组(52.5±4.01 vs 37.33±0.51,41.11±1.72,31±1.15,P<0.05)。后续试验采用1μmol/L+5μmol/LMG132联合处理方法进行。2.泛素-蛋白酶体通路对猪核移植胚胎重要母源因子表达的影响为了解MG132处理对重要母源因子表达的影响,揭示泛素蛋白酶体途径调控克隆胚胎发育潜能的机制,我们首先对Tet3、NLRP5和5-mC蛋白表达进行了免疫组化分析。结果显示,与未处理组相比,Tet3和NLRP5蛋白表达水平在MG132处理的MⅡ期卵母细胞和原核阶段的核移植胚胎中均显著升高(P<0.05);5-mC在未处理组和MG132处理组原核期胚胎中无明显荧光信号,2-细胞期胚胎中重新出现且随后呈现升高的趋势。为了验证MG132是否对DNA去甲基化的影响发生在更早的原核阶段,我们对6 h和12 h时间段的核移植原核胚胎进行分析。结果发现,与未处理组相比,在这2个时间段中,Tet3与5-mC的荧光信号比率在MG132处理的核移植胚胎中均极显著升高(P<0.01),NLRP5蛋白表达水平显著提高(P<0.05)。采用qRT-PCR方法分析了卵母细胞和核移植胚胎中重要母源效应基因表达水平。结果发现,NPM2、Zar1、NLRP5和Tet3基因在未处理组和MG132组卵母细胞及早期分裂核移植胚胎中均有较高的表达,从核移植2-细胞期胚胎至囊胚期明显下降,在囊胚期降至最低。NPM2,Zar1,NLRP5和Tet3基因表达水平在MG132处理的MⅡ期卵母细胞和核移植原核胚中都显著升高(P<0.05),这些基因的表达规律与免疫荧光的结果相一致。3.MG132处理对猪卵母细胞和核移植胚胎组蛋白修饰和ZGA相关基因表达的影响首先采用免疫组化方法分析了 MG132处理对成熟阶段猪卵母细胞H3K4me3和H3K9me3蛋白表达的影响。结果显示,未处理组猪卵母细胞体外成熟过程中,H3K4me3水平从GV期至MⅡ期不断降低,在GVBD期达到最低;H3K9me3水平从GV期至GVBD期呈现上升趋势,在GVBD期达到最高,Pre-MⅠ期至MⅡ期未检测到H3K9me3荧光信号。1μmol/L MG132处理组AT-Ⅰ和MⅡ期卵母细胞中H3K4me3表达水平均显著高于未处理组,未检测到H3K9me3荧光信号。为了解泛素-蛋白酶体通路和组蛋白去乙酰化调控对猪核移植胚胎发育的不同影响,分别使用MG132和TSA两种药物处理胚胎。结果显示,MG132和TSA处理的核移植胚胎4-细胞率(64.94%,60.66%vs 49.61%,P<0.05)、囊胚率(29.91%,23.77%vs 13.95%,P<0.05)以及囊胚细胞总数均显著高于未处理组,两处理组之间没有显著差异(P>0.05)。与未处理组相比,MG132和TSA处理均能提高2-、4-细胞期猪核移植胚胎RNApolⅡ蛋白水平;与未处理组和TSA处理组相比,MG132处理显著提高了 2-、4-细胞期猪核移植胚胎中eIF3A和TFⅡA基因的表达水平(P<0.05);与未处理组相比,添加TSA同样能够显著提高2-、4-细胞期猪核移植胚胎中eIF3A和TFⅡA基因的表达水平(P<0.05),但其4-细胞核移植胚胎的eIF3A和TFⅡA基因表达水平显著低于MG132处理组(P<0.05)。利用细胞免疫组化和qRT-PCR技术进一步分析了组蛋白修饰及相关修饰酶基因在猪核移植胚胎中的表达状况。结果显示,与未处理组相比,MG132和TSA处理能显著提高1-和4-细胞期猪核移植胚胎中H3K4me3表达水平(P<0.05),并显著降低H3K9me3表达(P<0.05);同时MG132和TSA处理显著提高了 1-细胞期克隆胚胎H3K9ac水平(P<0.05),TSA处理显著提高了桑椹胚和囊胚中H3K9ac水平(P<0.05)。qRT-PCR结果显示,HAT1、HDAC1、HDAC2、ASHL2、SMYD3、KDM5A 和 KDM5B 基因在MG132和TSA处理组1-至4-细胞期核移植胚胎中有相近的表达趋势,HDAC1、HDAC2、KDM5A和和KDM5B基因在TSA处理的桑椹胚和囊胚中呈下降趋势,HAT1、HDAC1、HDAC2、SMYD3、KDM5A 和 KDM5B基因在MG132处理的桑葚胚和囊胚中的表达都显著高于TSA组和未处理组(P<0.05)。4.MG132处理对德保黑猪核移植胚胎质量的影响首先通过TUNEL法分析不同处理方法对核移植胚胎细胞凋亡的影响。结果发现MG132处理组核移植囊胚的细胞凋亡数显著低于未处理组(P<0.05),TSA处理组囊胚细胞凋亡数有所降低.,但与未处理组和MG132处理组相比没有显著差异(P>0.05)。其次,通过免疫组化技术对核移植囊胚的多能性、滋养层和内细胞团分化状况进行了检测。结果显示,与未处理组相比,MG132和TSA处理均能显著提高猪核移植囊胚中Oct4蛋白的表达(P<0.05),且MG132处理组的Oct4蛋白表达显著高于TSA处理组(P<0.05)。CDX2蛋白免疫组化结果显示,与未处理组相比,MG132和TSA处理均能显著提高囊胚细胞总数(51.2±5.8,51.0±5.6vs35.7±4.2,P<0.05),但内细胞团细胞数(ICM)没有显著差异(11.43±4.3 vs 9.71±2.8,P>0.05)。从ICM占细胞总数的比率结果来看,TSA处理显著高于MG132和未处理组(29.03%vs 23.27%,18.01%,P<0.05)。为进一步了解MG132处理对猪核移植胚胎发育质量影响的分子机理,采用qRT-PCR方法分析了凋亡相关基因、多能性相关基因等在核移植胚胎中的表达水平。结果显示,与对照组相比,MG132处理显著抑制了核移植囊胚中Bax基因的表达,并且显著提高了 Bcl-2,Nanog,Oct4和CDX2基因的表达水平(P<0.05);TSA处理显著降低了核移植囊胚中Bax基因的表达,显著提高了 Nanog,Oct4基因的表达水平(P<0.05),但是显著降低了CDX2基因的表达水平(P<0.05)。最后,探讨了 MG132处理对核移植胚胎全程发育能力的影响。结果发现,在移植的4个批次中,只有一个移植MG132处理胚胎的批次获得了流产胎儿。采用DNA微卫星方法分析了流产胎儿、供体细胞、受体母猪以及对照组组织DNA的亲缘关系,结果显示,流产胎儿基因组来源于供体细胞,初步证实获得了 MG132处理的体细胞克隆猪。以上结果表明,(1)MG132处理对猪卵母细胞核成熟没有影响,可降低成熟卵母细胞活性氧水平,并促进皮质颗粒完全迁移至皮质区;(2)MG132处理能够在一定程度上调控猪卵母细胞和核移植胚胎中母源蛋基因的表达水平,提高核移植原核胚DNA去甲基化能力;(3)MG132处理能够促进德保黑猪猪核移植胚胎合子基因启动,同时在一定程度上调控德保黑猪核移植胚胎中组蛋白表观遗传修饰基因的表达;(4)MG132处理能够降低德保黑猪核移植胚胎囊胚细胞凋亡,并且促进TE和ICM的分化以及多能性因子的表达;(5)优化的MG132处理条件能够生产德保克隆黑猪。