论文部分内容阅读
高温α-淀粉酶(BLA)是目前最重要的工业酶制剂之一，广泛应用于酿造、食品加工、酒精等工业。实现BLA的高效制备对进一步提升其工业应用价值具有重要意义。本研究前期工作中，已围绕BLA编码基因克隆与功能鉴定、BLA高效表达载体及宿主细胞等进行了较深入的研究。本研究对一种全新的启动子PQ介导BLA的表达进行了研究，分别在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中研究和鉴定了新型芽孢杆菌启动子PQ的功能，证实了启动子PQ在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中具有高效介导BLA表达的能力。主要研究内容如下：
⑴首先以B.licheniformis B0204染色体DNA为模板PCR扩增获得含信号肽序列的BLA编码基因(amyL)，克隆入载体pLakr中，构建成重组质粒pLa-amyL，再在amyL基因的上游插入人工合成的启动子PQ，获得重组质粒pLa-Gm-PQ-amyL。在重组大肠杆菌中，amyL基因能够在启动子PQ的介导下成功表达，重组菌表达的高温α-淀粉酶的酶活力大小为16.1 U/mL。表明启动子PQ能在大肠杆菌中有效介导BLA的表达。
⑵比较研究了启动子PQ在枯草芽孢杆菌中介导基因表达的能力。分别用启动子PQ和启动子P43构建了表达载体pUB-PQ-amyL和pUB-P43-amyL，并转化入枯草芽孢杆菌1A717(△amyA)中。重组枯草芽孢杆菌在淀粉平板上的水解淀粉能力差异显著。重组菌进行摇瓶发酵105 h后，测定BLA酶活:B.subtilis(pUB-PQ-amyL)的最高酶活为280 U/mL；B.subtilis(pUB-P43-amyL)的最高酶活为191 U/mL。实验表明在枯草芽孢杆菌中启动子PQ转录强度优于已鉴定的强启动子P43，由启动子PQ介导的BLA最高表达水平是启动子P43介导的最高表达水平的1.47倍。表明启动子PQ能够更高强度的介导BLA在枯草芽孢杆菌中的表达。
⑶将pUB-PQ-amyL和pUB-P43-amyL转化入地衣芽孢杆菌CBB D302，获得重组菌后进行摇瓶发酵测定BLA酶活，B.licheniformis CBB D302(pUB-PQ-amyL)与宿主菌B.licheniformis CBB D302相比产酶水平提高了61%；B.licheniformis CBB D302(pUB-P43-amyL)的产酶水平提高了21%；由启动子PQ介导的BLA最高表达水平约为启动子P43介导的最高表达水平的3倍。表明启动子PQ在地衣芽孢杆菌中介导BLA的表达能力优于已鉴定的强启动子P43。